里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆与表达

摘要

纤维二糖水解酶是能够高效降解木质纤维素的里氏木霉纤维素酶的重要组分之一，是纤维素酶催化水解结晶区纤维素的关键。本文从里氏木霉（Trichoderma reesei）ZU-02中克隆出了cbh2基因，并研究其在大肠杆菌、毕赤酵母、里氏木霉中的表达。
　　采用反转录PCR获得里氏木霉cbh2基因，用其构建重组载体，转入大肠杆菌。IPTG诱导产酶结果表明:里氏木霉cbh2基因已在大肠杆菌中成功实现胞内表达。
　　分别采用里氏木霉cbh2基因和经过密码子优化的cbh2s基因构建重组载体，并在毕赤酵母中进行表达。筛选获得2株优良转化子，分别包含cbh2(PC-1)和cbh2s(PC-2)。发酵液SDS-PAGE结果显示在约58 kDa处有单一明显条带，为重组CBHⅡ，即cbh2基因在毕赤酵母中的表达产物，其中包含了约5 kDa的糖基化。
　　对转化子PC-1和PC-2的产酶性能进行了比较实验，诱导发酵96 h，PC-2的纤维二糖水解酶活力是PC-1的2.02倍，PC-2的可溶性蛋白是PC-1的1.66倍。研究结果表明:密码子优化策略促进了里氏木霉cbh2基因在毕赤酵母中的异源表达。
　　研究了重组毕赤酵母所产CBHⅡ的最适pH与最适温度，分别是5.0和50℃。模拟了CBHⅡ的CBD和CD区域的三维模型。
　　为了提高里氏木霉纤维素酶的协同降解能力，将cbh2基因置于里氏木霉的强启动子Pcbh1及其信号肽下游，并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架，构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入里氏木霉宿主细胞。优化了影响农杆菌介导里氏木霉转化的诸因素，使得转化率大幅提高。针对筛选里氏木霉高产纤维二糖水解酶转化子的特殊要求，采用潮霉素抗性筛选与菌落在微晶纤维素平板上的生长速率筛选相结合的两步法筛选，从326个里氏木霉转化子中筛选出10个优良转化子。
　　对重组里氏木霉转化子(C10)的产酶性能进行了研究，采用优化后的培养基和产酶条件。摇瓶条件下发酵120 h，重组里氏木霉的内切葡聚糖酶活力和纤维二糖酶活力与初始菌株相比没有明显变化，但其纤维二糖水解酶活力为122.44U/mL，是初始菌株的5.4倍。由于重组里氏木霉纤维素酶系组成中纤维二糖水解酶活力明显提高，其纤维素酶总活力（滤纸酶活力）也提高到初始菌株的4.3倍。
　　对重组纤维素酶在木质纤维素降解中的应用性能进行了研究。以初始菌株ZU-02纤维素酶为参照，在同等条件下，重组纤维素酶对玉米秸秆的酶解得率高达93.8％，而ZU-02纤维素酶的酶解得率为81.1％。本文的研究成果对于纤维素酶的定向进化以及纤维素资源的转化与利用具有重要的促进作用。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 里氏木霉纤维素酶体系

1．3 其它来源的纤维素酶

1．4 外源蛋白在里氏木霉中的表达

1．4．1 里氏木霉的基因工程策略

1．4．2 里氏木霉的转化策略

1．4．3 里氏木霉的基因定向整合

1．4．4 定向整合的RNA工具

1．4．5 里氏木霉基因工程综合策略

1．5 里氏木霉的基因表达调控

1．5．1 纤维素酶的诱导物

1．5．2 里氏木霉对不溶性底物的识别

1．5．3 纤维素酶启动子的结构

1．5．4 纤维素酶的转录调控

1．5．5 调节纤维素酶表达的信号途径

1．6 里氏木霉胞外蛋白的分泌途径

1．6．1 通往内质网的途径

1．6．2 内质网中的蛋白成熟

1．6．3 内质网质量控制

1．6．4 后内质网途径

1．6．5 蛋白质糖基化

1．7 cbh2基因工程研究进展

2 里氏木霉cbh2基因的克隆与在大肠杆菌中的表达

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 质粒与菌株

2．2．2 工具酶与试剂

2．2．3 培养基

2．2．4 实验仪器

2．2．5 里氏木霉cbh2基因的克隆与重组质粒的构建

2．2．6 大肠杆菌的转化

2．2．7 里氏木霉cbh2基因在大肠杆菌中的表达

2．2．8 测定方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 反转录PCR获得里氏木霉cbh2基因

2．3．2 克隆载体的酶切验证

2．3．3 表达载体的PCR验证

2．3．4 里氏木霉cbh2基因序列分析

2．3．5 里氏木霉cbb2在大肠杆菌中的诱导表达

2．4 小结

3 里氏木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 质粒与菌株

3．2．2 工具酶与试剂

3．2．3 培养基

3．2．4 实验仪器

3．2．5 毕赤酵母表达载体的构建

3．2．6 大肠杆菌的转化

3．2．7 里氏木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

3．2．8 测定方法

3．2．9 统计学分析

3．2．10 CBH Ⅱ蛋白结构的预测与模拟

3．3 结果与讨论

3．3．1 毕赤酵母表达载体的构建与PCR验证

3．3．2 重组毕赤酵母的诱导与发酵

3．3．3 重组蛋白的SDS-PAGE

3．3．4 重组CBH Ⅱ的酶学性质研究

3．3．5 CBH Ⅱ蛋白结构的预测与模拟

3．4 小结

4 里氏木霉转化方法与转化子筛选方法的建立与优化

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 质粒与菌株

4．2．2 工具酶与试剂

4．2．3 培养基

4．2．4 实验仪器

4．2．5 重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT的构建

4．2．6 大肠杆菌的转化

4．2．7 根瘤农杆菌介导的里氏木霉转化

4．2．8 里氏木霉转化子的筛选与鉴定

4．2．9 产酶实验

4．2．10 测定方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT的构建

4．3．2 农杆菌介导转化过程的优化

4．3．3 农杆菌转化子所含质粒的酶切验证

4．3．4 里氏木霉转化子的遗传稳定性检验及PCR验证

4．3．5 里氏木霉筛选方法的建立

4．3．6 里氏木霉转化子生长速率与酶活的关系

4．4 小结

5 里氏木霉转化子的产酶研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 菌株

5．2．2 试剂

5．2．3 实验仪器

5．2．4 培养基

5．2．5 产酶实验

5．2．6 测定方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 纤维二糖水解酶活力对比

5．3．2 滤纸酶活力对比

5．3．3 内切葡聚糖酶活力对比

5．3．4 纤维二糖酶活力对比

5．4 小结

6 里氏木霉纤维素酶降解木质纤维素的研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 菌株

6．2．2 酶制剂

6．2．3 实验仪器

6．2．4 培养基

6．2．5 产酶实验

6．2．6 木质纤维素降解

6．2．7 分析方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 酶用量对碱处理玉米秸秆和稻草的影响

6．3．2 添加纤维二糖酶的碱处理玉米秸秆和稻草酶水解

6．3．3 添加纤维二糖酶和木聚糖酶的碱处理玉米秸秆和稻草酶水解

6．3．4 不同来源纤维素酶酶解得率的比较

6．4 小结

7 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

7．3 论文的创新点

参考文献

作者简历

攻读博士学位期间发表的论文