里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

摘要

【目的】用分子改造的方法改造里氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维二糖水解酶基因cbh1，提高其纤维素酶活力，为工业化生产纤维素酶提供参考。【方法】用DNase Ⅰ消化里氏木霉cbb1，回收100bp左右的片段后用T4DNA连接酶连接，以连接产物作为模板进行PCR扩增，将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体，使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组。通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株，在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列。【结果】经克隆测序获得基因片段大小为637bp，与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88％-98％，确定为里氏木霉cbh1的基因片段。经DNaseⅠ消化15min、T4DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因。将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体，得到cbh1基因突变体库。从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1．7518倍的突变菌株E2-1。序列比对分析发现，与出发菌株相比，突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变，其中5个碱基为置换突变，8个碱基为缺失突变，1个碱基为插入突变，分布于cbh1基因的9个位置。【结论】改造后的cbhI基因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组，进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力。