酪氨酸磷酸酶Shp2对于NMDA受体酪氨酸磷酸化和突触可塑性调控的机制研究

摘要

包含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶2(Src homology2 domain containingphosphotyrosine phosphatase2， Shp2)是非受体酪氨酸磷酸酶的一种，在进化中高度保守。在患病人群中大约50％的Noonan综合征(Noonan syndrom， NS)是由Shp2的激活突变引起的，而大约80％的LEOPARD综合征(LEOPARD syndrom，LS)则是由它的失活突变引起。这两种疾病都是全身性的发育障碍病，并且均有一定比例的病人表现出智力障碍。虽然已有报道称Shp2能够通过调控下游Ras/ERK MAP激酶(MAPK)来参与记忆过程，但是内在机制依然不是很清楚。有报道称Shp2存在于N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体复合物中，并且有它和NMDA受体的GluN2B亚基直接相互作用的证据。NMDA受体是一类兴奋性离子型谷氨酸受体，主要通透Ca2+。能够发挥功能的NMDA受体由2个组构性的GluN1亚基和两个调节性的GluN2或者GluN3亚基构成。它是配体和电压双门控的通道，能够响应突触前的谷氨酸释放和突触后的去极化，在突触可塑性中发挥了重要的作用。
　　基于此，我们采用Shp2 FloxP/FloxP小鼠与CaMKⅡα-Cre小鼠杂交得到在前脑兴奋性神经元中特异敲除Shp2的小鼠(Shp2Floxp/Floxp: CaMKⅡα-Cre+/-，CaSKO)来研究Shp2是否通过调节NMDA受体亚基磷酸化来调控突触可塑性乃至学习记忆功能。我们进行的蛋白检测表明CaSKO小鼠海马组织中Src激酶416位酪氨酸(Src Y416)磷酸化水平升高，这一位点代表了其酶活性，相应的NMDA受体的GluN2B亚基的1472位酪氨酸(GluN2BY1472)和GluN2A亚基的1325位酪氨酸(GluN2A Y1325)的磷酸化水平也特异性的升高。这使得突触部位NMDA受体的电流增加并且CaSKO小鼠海马CA1的锥体神经元上兴奋性突触传递也增加。我们进一步的分析表明，这些在CaSKO小鼠突触上增加的NMDA受体是三异聚体GluN1/GluN2A/GluN2B，并且这些受体对于锌离子抑制的敏感性增强，导致在高频刺激时通过该受体的电量减少。在场电位长时程突触增强(long-term potentiation，LTP)的测试中，我们发现敲除Shp2会削弱海马CA1由100 Hz/1s高频刺激诱导的LTP，而这种LTP的削弱正是与突触部位的NMDA受体对于锌离子抑制的敏感性增加相关。
　　此外，我们进一步发现CaSKO小鼠的长时程场景恐惧记忆被削弱，而场景恐惧记忆的形成和短时记忆则不受影响。对于场景恐惧记忆前后小鼠海马组织中这些蛋白的磷酸化检测发现WT小鼠在场景恐惧记忆检测后SrcY416的磷酸化升高，并且GluN2B Y1472的磷酸化也相应上升，而在CaSKO小鼠中这些位点已经升高的磷酸化水平并未出现活性依赖的升高。通过对CaSKO小鼠进行Src激酶抑制剂PP2的处理，我们发现能够反转Shp2缺失所引起的一系列后果。
　　据此，我们推断是Shp2敲除引起的Src激酶活性增高导致了NMDA受体亚基磷酸化水平的升高，从而使得更多的NMDA受体在突触部位表达，且功能性突触数目和其强度也增多。这种饱和作用导致了LTP的下降，并进一步影响长时程场景恐惧记忆。
　　这为我们理解酪氨酸磷酸酶在突触可塑性调控中的作用以及NS和LS中智力障碍的表型提供了新的思路。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

1．1 学习记忆以及突触可塑性

1．2 NMDA受体在突触可塑性及学习记忆中的作用

1．3 NMDA受体的酪氨酸磷酸化调控

1．4 酪氨酸磷酸酶Shp2在中枢神经系统可塑性及记忆中作用的研究现状

1．4 我们的研究

2 材料和方法

2．1 实验仪器及试剂

2．2 实验方法

3．结果

3．1 Shp2缺失增强海马组织中Src激酶活性并且使NMDA受体GluN2A亚基1325酪氨酸位点和GluN2B亚基1472酪氨酸位点磷酸化增加

3．2 CaSKO小鼠整体脑区发育正常

3．3 海马锥体神经元中敲除Shp2引起成熟突触的增加

3．4 Shp2缺失引起NMDA受体对锌离子抑制敏感性增高，削弱海马CA1区的LTP

3．5 CaSKO小鼠空间恐惧记忆的消退加快

3．6 CaSKO小鼠空间记忆正常

3．7 CaSKO小鼠海马中Sre家族激酶和GluN2B Y1472位点磷酸化依赖于活性的升高消失

3．8 Src激酶抑制剂PP2处理能够挽救Shp2缺失导致的后果

4 讨论

4．1 NMDA受体能够被酪氨酸磷酸酶Shp2间接调节其酪氨酸磷酸化

4．2 Shp2对于不同信号通路的调节分选

4．3 Shp2缺失引起的NMDA受体在突触部位的亚基分布问题

4．4 Shp2缺失对于突触可塑性的影响

4．5 Shp2缺失对于长时程场景恐惧记忆的影响

4．6 我们的研究对于理解疾病的贡献

5 结论

参考文献

综述

作者简介及在读期间所取得的科研成果