XRCC1介导DNA复制损伤修复及其在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用的机制研究

摘要

DNA复制叉(DNA replication fork)是DNA复制的基本结构，它的完整性对基因组稳定性的维持至关重要，直接决定了细胞的命运。在机体内外各种复制压力的作用下，DNA复制叉极易受到干扰，产生损伤，导致DNA复制停滞。严重者可以影响基因组的稳定性，诱发细胞的癌变、凋亡、坏死等。DNA复制叉稳定性的维持是一个错综复杂的过程，需要多种DNA损伤修复蛋白的参与。
　　X线修复交错互补、基因1(X-ray repair cross complementing gene1，XRCC1)是一个重要的DNA损伤修复基因。它的编码蛋白XRCC1主要由3个结构域组成，即氨基端的结构域（NTD，1-183氨基酸区域）、羧基端的乳腺癌易感基因羧基端2结构域(BRCTⅡ)、中间的乳腺癌易感基因羧基端1结构域(BRCTⅠ)。XRCC1可以借助其结构域与DNA聚合酶β、DNA连接酶3α等多种DNA损伤修复蛋白结合。XRCC1主要参与DNA的单链损伤修复(Single strand break repair, SSBR)和碱基切除修复(Base excision repair，BER)。已有研究表明，XRCC1可以在DNA复制叉处聚集。但XRCC1对DNA复制叉停滞的重新启动方面的研究，目前尚未见报道。
　　聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose) polymerase，PARP)是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶。它通过识别结构损伤的DNA片段而被激活，被认为是DNA损伤的感受器。研究表明，在DNA单链损伤修复过程中，XRCC1在PARP酶的作用下聚集到损伤位点。
　　DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)由催化亚单位(DNA-PK catalytic subunit，DNA-PKcs)、调节亚单位（KU，包括Ku70、Ku80）组成，它是DNA损伤修复的重要酶，主要通过非同源性末端接合(Non-homologousend joining, NHEJ)的方式，参与DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)的损伤修复。当DNA双链断裂，Ku70、Ku80快速的识别、结合DNA断端，激活DNA-PKcs，招募DNA连接酶Ⅳ-XRCC4复合体到DNA断端，修复连接断裂的DNA双链。研究表明，XRCC1对DNA单链损伤的修复作用，需要DNA-PK的磷酸化作用。
　　根据以上研究，我们提出假设:XRCC1在PARP酶或DNA-PK的作用下，聚集到DNA复制叉停滞处，并促进DNA复制叉停滞的重新启动。
　　同源重组(Homologous recombination，HR)主要通过利用未受损伤的另一条染色体作为模版，来修复与其相似的受损伤的染色体。DNA单链损伤修复主要通过激活PARP酶的活性来实现。同源重组为主导的DNA双链断裂损伤修复与PARP主导的DNA单链断裂损伤修复可以互相补充代偿。在正常组织细胞中，两种修复方式共存，共同保障细胞的存活。抑制其中一种机制不会产生致命的影响;然而，在某些病变组织中（如肿瘤细胞），往往存在其中某一种修复方式缺陷，此时若阻断剩余的修复方式即可选择性地杀死病变组织细胞。这种理论被称为“合成致死”(Synthetic Lethal)。
　　近年来，随着研究的深入，越来越多的靶向DNA损伤修复通路的小分子抑制剂被研发用于肿瘤的治疗。如PARP1抑制剂奥拉帕尼（Olaparib）已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准应于治疗同源重组修复缺陷的肿瘤患者。然而，由于同源重组修复缺陷主要见于卵巢癌、乳腺癌患者，而在其他肿瘤细胞相对较少出现，这就限制了PARP1抑制剂的使用范围。欧夹竹桃苷(Oleandrin)是从中草药夹竹桃中提取分离出来的一种单体化合物，它具有很好的抗肿瘤作用。我们前期研究发现，欧夹竹桃苷能够诱导肿瘤细胞的DNA单链结构增多及XRCC1的表达增加，提示可能引起DNA损伤。据此，我们提出假设:欧夹竹桃苷抑制同源重组修复。如果成立，欧夹竹桃苷与Olaparib联合使用，将扩大PARP抑制剂的使用范围，为肿瘤的治疗提供一个新的策略。
　　本实验分成两部分进行研究:(1)探求XRCC1对DNA复制叉停滞、重新启动的作用机制，及PARP1、DNA-PKcs在这个过程中对XRCC1的调控作用;(2)明确DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤中的作用，并探求一种新的靶向DNA损伤修复反应的抑制剂。
　　第一部分 XRCC1介导DNA复制损伤修复的机制研究
　　目的:
　　研究XRCC1对DNA复制叉停滞的保护及其重新启动的影响，并探讨PARP1、DNA-PKcs对XRCC1的调控作用。
　　方法:
　　(1)为了探讨XRCC1在DNA复制叉停滞处表达，我们用羟基脲(Hydroxyurea，HU)干预人的骨肉瘤细胞(U2OS)，免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测XRCC1表达，以及XRCC1分别与5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）、细胞周期蛋白A(Cyclin-A)的共定位情况。
　　(2)为了探讨在DNA复制叉停滞时，PARP1对XRCC1的调控作用，我们用HU与Olaparib一起干预U2OS细胞，免疫荧光检测XRCC1焦点(foci)的形成，观察当PARP1的活性被抑制以后，XRCC1的表达。
　　(3)为了探讨XRCC1在DNA复制叉停滞处的聚集，对DNA复制叉停滞的保护及其重新启动的作用，我们用HU干预EM9-V（XRCC1基因缺陷）、EM9-XH（XRCC1表达正常）细胞，DNA纤维形成实验（DNA fiber）检测DNA复制叉停滞和重新启动的情况;
　　(4)克隆形成实验，检测在HU的复制压力作用下，XRCC1对细胞增殖的影响;
　　(5)为了明确RAD51对DNA复制叉停滞的保护作用，我们用HU干预U2OS细胞,蛋白质免疫印迹实验(western blot)检测RAD51的表达;
　　(6)为了明确Mre11对XRCC1表达的影响，我们用Mirin（Mre11抑制剂）干预U2OS细胞，HU干预EM9-V、EM9-XH细胞，免疫荧光分别检测XRCC1、Mre11的表达;Mirin干预EM9-V、EM9-XH细胞，克隆形成实验检测在XRCC1、Mre11都缺陷的情况下，细胞的增殖状况。并采用Mirin与Olaparib共同干预U2OS细胞，免疫荧光检测PARP1对Mirin诱导的XRCC1表达的影响;
　　(7)为了观察蛋白激酶2(Casein Kinase2，CK2)对XRCC1表达的影响，我们用HU干预EM9-V、EM9-XH、EM9-CKM细胞，western blot检测XRCC1的表达;在HU干预的U2OS细胞中，加入CK2抑制剂TBB，western blot检测XRCC1的表达;
　　(8)为了检测DNA-PKcs对XRCC1的影响，我们用HU干预DNA-PKcs缺陷的V3-3细胞和野生型的AA8细胞，免疫荧光检测XRCC1焦点的阳性细胞;DNA-PKcs特异性的siRNA基因沉默U2OS细胞的DNA-PKcs，再用HU干预，western-blot检测XRCC1表达;HU处理GFP-XRCC1-U2OS细胞，检测XRCC1与DNA-PKcs共定位情况;
　　(9)为了进一步研究XRCC1在DNA-PKcs的作用下，对DNA复制叉的影响，我们用siRNA基因沉默EM9-V和EM9-XH细胞的DNA-PKcs，然后进行DNA fiber实验，检测DNA复制叉的停滞和重新启动情况。
　　结果:
　　(1)在HU的复制压力作用下，XRCC1焦点阳性细胞的百分比增加，XRCC1焦点与EdU共定位，且仅仅在Cyclin-A阳性的细胞中表达，表明XRCC1在DNA复制叉停滞处聚集;
　　(2)PARP1的活性被抑制，HU无法诱导XRCC1的表达增加，表明XRCC1在DNA复制叉停滞处的聚集依赖于PARP1的调控作用;
　　(3)与EM9-XH细胞相比，EM9-V细胞的DNA复制叉停滞百分比显著增高，表明XRCC1可以保护停滞的DNA复制叉并促进其重新启动;
　　(4)在HU的复制压力作用下，EM9-V细胞的克隆形成受到抑制，而EM9-XH细胞的克隆形成无明显影响，提示在HU作用下，XRCC1可以促进细胞的存活;
　　(5)在HU的作用下，XRCC1的表达在2h较高，而RAD51在24h表达较高，提示随着DNA复制叉停滞时间的延长，RAD51介导的同源重组修复可能参与DNA复制叉停滞的修复;
　　(6)Mre11抑制剂Mirin可以诱导U2OS细胞XRCC1表达增加;在HU的作用下，EM9-V细胞中Mre11表达显著高于EM9-XH细胞，提示Mre11也参与了对DNA复制叉停滞的修复;
　　(7)当CK2活性被抑制以后，HU无法诱导XRCC1的表达增加，提示XRCC1的表达要依赖CK2的磷酸化作用;
　　(8)在DNA-PKcs缺陷的V3-3细胞， HU无法诱导XRCC1的表达增加;免疫荧光检测发现，XRCC1与DNA-PKcs共定位，表明XRCC1的表达要依赖DNA-PKcs的调控作用;
　　(9)DNA-PKcs被基因沉默以后，DNA复制叉停滞增加，表明DNA-PKes保护停滞的DNA复制叉，并促进其重新启动。
　　结论:
　　(1)XRCC1在PARP1、DNA-PKcs的调控作用下，募集到DNA复制叉停滞处，保护停滞的DNA复制叉，并促进其重新启动;
　　(2)XRCC1在DNA复制叉处的聚集，可以促进细胞的存活;
　　(3)XRCC1的表达依赖于CK2的磷酸化作用;
　　(4)Mre11、RAD51可以保护停滞的DNA复制叉。
　　第二部分 DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用机制中的研究
　　目的:
　　探讨DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用中的机制，并寻求一种新的同源重组抑制剂。
　　方法:
　　(1)为了探讨欧夹竹桃苷的抗肿瘤作用，我们体外培养肺癌细胞(A549、H1299)，予以欧夹竹桃苷干预，流式细胞仪检测细胞的凋亡;
　　(2)为了探讨欧夹竹桃苷对DNA损伤的影响，我们体外培养A549、H1299细胞，予以欧夹竹桃苷干预后，免疫荧光、western blot检测RPA、γH2AX表达;
　　(3)为了探讨欧夹竹桃苷对DNA损伤修复通路的影响，我们体外培养A549、H1299细胞，予以欧夹竹桃苷干预后，western blot检测RAD51、XRCC1的表达;
　　(4)为了检测欧夹竹桃苷对细胞周期的影响，我们体外培养A549细胞，予以欧夹竹桃苷干预后，流式细胞仪检测细胞周期的阻滞情况;
　　(5)为了验证欧夹竹桃苷对同源重组修复的影响，我们用XRCC1特异性的siRNA基因沉默A549细胞的XRCC1基因，然后予以欧夹竹桃苷干预，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
　　结果:
　　(1)欧夹竹桃苷干预后，肺癌细胞的凋亡率明显增加，增殖受到抑制;
　　(2)欧夹竹桃苷可以诱导肺癌细胞的DNA损伤蛋白RPA、γH2AX表达增加;
　　(3)欧夹竹桃苷诱导肺癌细胞的RAD51表达降低，XRCC1的表达增加，表明欧夹竹桃苷可以抑制同源重组修复，活跃DNA单链损伤修复;
　　(4)我们用XRCC1特异性siRNA基因沉默XRCC1后，肺癌细胞对欧夹竹桃苷的敏感性增强、细胞生长明显受到抑制，进一步验证了欧夹竹桃苷对同源重组修复通路的抑制作用，及“合成致死”理论。
　　结论:
　　(1)欧夹竹桃苷可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，具有一定的抗肿瘤作用;
　　(2)欧夹竹桃苷的抗肿瘤作用与DNA损伤有关;
　　(3)欧夹竹桃苷可以抑制同源重组修复，可能是一种有效的同源重组抑制剂。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词中英文对照

第一部分 XRCC1介导DNA复制损伤修复的机制研究

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 研究结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二部分 DNA损伤修复反应在欧夹竹桃苷抗肿瘤作用机制中的研究

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．3 研究结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

综述 DNA损伤修复反应在肿瘤中的研究进展

作者简历及科研成果