核仁蛋白Def与半胱氨酸蛋白酶CAPN3的互作研究及其在核仁中的靶蛋白鉴定

摘要

核仁不仅是核糖体合成与加工的场所，也与细胞周期调控、DNA损伤修复、压力信号应答等生化过程有关。核仁作为细胞核内致密的非膜细胞器，富集了超过4,500种不同蛋白质。然而，人们对于这些蛋白质在核仁中的功能以及这些蛋白在核仁中是如何被调控的所知甚少。本实验室之前的研究发现核仁蛋白Def(Digestive-organ expansion factor)能够介导半胱氨酸蛋白酶CAPN3(Calpain3)降解p53。但是并不清楚Def如何帮助CAPN3降解p53，也不知Def-CAPN3在核仁内是否还存在其他靶蛋白。
　　本研究首先发现人CAPN3能够降解p53A138V、p53M2371、p53R248W和p53R273P，而不能降解p53R175H。p53R175H作为癌症样品中出现频率最高的p53点突变，提示了CAPN3在肿瘤形成中的意义。通过免疫共沉淀实验，证明Def与人CAPN3能够直接互作，并在核仁内形成蛋白复合体。发现这种互作在斑马鱼上也具有保守性，斑马鱼Def能够与Capn3b（人CAPN3在斑马鱼上的同源蛋白）在核仁内形成蛋白复合体。进一步的研究发现，Def能够通过磷酸化修饰调控其与CAPN3的结合能力，招募CAPN3进入核仁降解p53。此外，Def-CAPN3对细胞周期及斑马鱼器官发育的调控也是部分通过p53实现的。
　　在两个不同的capn3b基因敲除品系斑马鱼的肝脏细胞中，p53都大量积累于核仁。虽然该斑马鱼纯合突变体可正常繁育，但是成年鱼表现出体长变短、躯体易侧弯的症状，与capn3基因突变引起的先天性肢带型肌肉营养不良(LGMD2A)症状类似。
　　为了寻找Def-CAPN3在核仁内的其他靶蛋白，通过蛋白质组学技术分析了capn3b基因敲除斑马鱼与野生型斑马鱼肝脏细胞核仁中差异表达的蛋白，发现了119个在capn3b突变鱼中上调（超过1.45倍）的核蛋白，其中核仁蛋白33个。对其中8个候选蛋白进行体内、体外的验证实验，证明其中7个（LmnA、Nkap、Ddx18、Cdk9、Hmgb1、Tra2a、Bbof1）蛋白能够被CAPN3降解，而且能够被Def诱导降解。此外，通过对蛋白质组学数据的深入分析，发现Capn3b还参与了免疫系统的调节，这解释了为何部分LGMD2A患者在发病早期出现炎症反应。
　　综上所述，研究首次阐明了Def-CAPN3降解途径能够在核仁内通过对靶蛋白的降解，调控细胞周期进程及器官发育。作为首个斑马鱼核仁蛋白质组学研究，我们的工作不仅为斑马鱼核仁蛋白功能的研究提供了帮助，也通过这种方法鉴定出了7个Def-CAPN3的新底物，为Def-CAPN3的功能研究提供了新的基础。此外，所构建的capn3基因敲除斑马鱼能够作为LGMD2A疾病研究模型，将来可用于药物筛选。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 半胱氨酸蛋白酶家族及Calpain3(CAPN3)

1．1．1 半胱氨酸蛋白酶家族Calpains

1．1．2 CAPN3的发现

1．1．3 CAPN3蛋白的结构与功能

1．1．4 CAPN3与人类疾病LGMD2A

1．2 抑癌因子p53

1．2．1 p53的发现

1．2．2 p53的功能及调控

1．2．3 p53的点突变与癌症

1．3 核仁的结构和功能

1．3．1 核仁的结构

1．3．2 核仁是核糖体合成、加工的场所

1．3．3 核仁的其他功能

1．4 核仁蛋白Def

1．5 斑马鱼作为模式生物的优势

1．5．1 斑马鱼作为模式生物的历程

1．5．2 斑马鱼作为模式生物的优势

1．5．3 斑马鱼与免疫学研究

1．6 本研究的内容、目的和意义

2．1．1 斑马鱼伦理

2．1．2 斑马鱼饲养

2．1．3 斑马鱼的交配及受精卵的收集

2．1．4 斑马鱼品系

2．2 细胞系及细胞操作

2．2．1 本课题所用细胞系

2．2．2 细胞系培养和冻存

2．2．3 细胞转染

2．3 抗体

2．4 DNA相关操作方法

2．4．1 基因克隆

2．4．2 PCR及DNA酶切产物的纯化

2．4．3 酶切与连接

2．4．4 基因组DNA的抽提

2．5 大肠杆菌操作

2．5．1 菌株

2．5．2 热激法转化感受态细胞及大肠杆菌培养

2．5．3 菌液冻存

2．5．4 质粒抽提

2．5．5 菌落PCR

2．6 蛋白质相关操作

2．6．1 蛋白样品的制备(SDS裂解法)

2．6．2 蛋白免疫印迹(Western blot)

2．6．3 免疫共、沉淀(Co-IP)

2．6．4 GST pull-down实验

2．6．5 抗体免疫荧光染色

2．7 体外酶活实验

2．8 真核表达系统表达蛋白及纯化

2．9 核仁分离

2．9．1 细胞系核仁分离

2．9．2 斑马鱼成鱼肝脏核仁分离

2．10 细胞流式计数分析

2．10．1 细胞系流式计数分析

2．10．2 斑马鱼胚胎肝脏细胞流式计数分析

2．11 mRNA的体外合成

2．12 斑马鱼显徼注射

2．13 斑马鱼胚胎整胚原位杂交(WISH)

2．14 蛋白质组学分析

2．15 TALENs技术构建基因敲除品系斑马鱼

2．16 生物信息学分析

2．17 本研究所用Morpholino、siRNA及引物序列

第三章 p53是CAPN3的底物

3．1 p53上有两个CAPN3的识别位点

3．2 野生型p53在体外能被CAPN3水解成小片段

3．3 p53R175H对CAPN3不敏感

3．3．1 在体外酶活实验中，p53R175H无法被CAPN3降解

3．3．2 His-CAPN3蛋白的表达

3．3．3 粗蛋白抽提液中His-CAPN3酶活性的检测

3．3．5 p53R175H对纯化后的His-CAPN3不敏感

3．4 小结与讨论

第四章 Def-CAPN3在核仁中形成蛋白复合体

4．1 核仁分离技术的建立

4．1．1 HepG2细胞核仁分离

4．1．2 成年斑马鱼肝脏细胞核仁分离

4．2 Def与CAPN3形成蛋白复合体

4．2．1 人hu-Def能够与人CAPN3互作

4．2．2 斑马鱼Def能够与斑马鱼Capn3b互作

4．2．3 人类及斑马鱼Def-CAPN3结合位点的探索

4．2．4 Def-CAPN3还可能结合其他蛋白

4．3 小结与讨论

第五章 Def通过磷酸化修饰招募CAPN3进入核仁

5．1 Def招募CAPN3进入细胞核仁

5．2 Def的N端磷酸化修饰影响了Def与CAPN3的结合

5．3 Def的N端磷酸化修饰影响了斑马鱼Capn3b进入核仁

5．4 小结与讨论

第六章 Def-CAPN3-p53降解通路对细胞周期的影响

6．1 在细胞系中敲降hu-Def或CAPN3会引起p53依赖的细胞周期抑制

6．2 Def对肝脏发育的促进作用部分依赖于p53通路

6．3 Def的N端磷酸化能够调控斑马鱼肝脏细胞周期进程

6．4 小结与讨论

第七章 通过核仁蛋白组学寻找Def-CAPN3的靶蛋白

7．1 capn3b基因敲除斑马鱼的表型研究

7．1．1 capn3b基因敲除斑马鱼的鉴定

7．1．2 capn3b基因藏除斑马鱼肝脏细胞核仁内p53增多

7．1．3 p53影响3b-／-突变体幼鱼的存活率

7．2 斑马鱼肝脏核仁蛋白质质谱数据分析

7．2．1 质谱蛋白样品的准备

7．2．2 质谱数据分析

7．3 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定

7．4 小结与讨论

8．1 结论

8．2 讨论

8．2．1 CAPN3的核仁定位

8．2．2 Def-CAPN3对细胞周期的调控

8．2．3 Def-CAPN3与肿瘤

8．2．4 建立核仁分育技术的价值

8．2．5 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定

参考文献

作者简介

致谢