水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns11的核仁定位及其与核仁蛋白Fibrillarin的互作

摘要

水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus,RDV),属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),是水稻普通矮缩病的病原,广泛分布于日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻种植区,并且在我国南方水稻产区普遍发生,并有不同程度的流行,给我国水稻生产造成严重损失。利用Affymetrix水稻全基因组芯片检测RDV侵染抗病水稻品种宜香2292(YX229)后基因表达的差异,其结果显示：水稻被RDV侵染后22d,其基因变化倍数大于1.5倍,p-value小于0.05的表达差异显著的基因有856个,其中上调的基因为838个,下调的为18个:其中,大量的核仁和核糖体相关基因被诱导。对具有明确的基因功能注释的581个差异表达基因,按其基因功能划分为14类,其中胁迫防御相关基因占13.77％,转录因子占9.98％,代谢相关基因占9.29％,信号转导相关基因占9.29％,蛋白质降解相关基因占8.43％,蛋白质生物合成相关基因占6.20％,转座及反转座子蛋白/RNA沉默路径中的相关基因占5.51％,细胞壁相关基因占5.16％,内源激素相关基因占2.41％,分泌路径相关基因占2.07％,运输相关基因占1.38％,细胞周期和细胞骨架相关基因分别占1.03％,而没有明确功能分类的基因居多,为24.44％。
　　 通过融合GFP表达实验,证实RDV编码的运动蛋白Pns6是一个膜定位蛋白,主要定位于细胞膜以及核膜和胞问连丝上;Pns10编码的RNA沉默抑制因子,其定位形式和Free eGFP相似,主要定位于细胞质;RDV Pns11是一个双定位信号分子,主要定位于细胞核和叶绿体。同时以烟草核仁基因Fibrillarin为Marker基因,根据RDV Pns11氨基酸序列结构特点,对Pns11的定位形式进行了进一步研究,结果表明:RDV Pns11是一个核仁定位信号分子(Nucleolus localizationsignals,NoLS),能够与Fibrillarin共定位,且RDV Pns11的核定位信号(Nuclearlocation signal,NLS)是Pns11定位细胞核和核仁所必需的。对RDV Pns11 NLS的缺失突变体的定位研究揭示,Pns11 NLS中的碱性氨基酸对核仁定位是至关重要的,其中NLS中132-144位8个碱性氨基酸“-RK--KKGGKK-”和Pns11NLS的C-端的6个碱性氨基酸“-RKSKRK-”是Pns11的核仁定位信号(NoLS),即是RDV Pns11定位核仁所必需的。
　　 为了深入研究RDV Pns11与核仁或核仁相关基因之间的关系,以水稻和烟草核仁基因所编码的Fibrillarin蛋白作为RDV Pns11潜在的靶蛋白,通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验揭示,RDV Pns11可能与Fibrillarin蛋白存在弱的相互作用;TRV病毒诱导Fibrillarin基因沉默试验表明:Fibrillarin基因沉默后烟草植株发育迟缓,顶端优势基本散失,植株矮化,新叶扭曲畸形和白化,这与RDV侵染水稻后所产生的病害症状存在一定的相似性,这暗示RDV侵染寄主后,可能通过改变核仁相关基因的表达或与其互作,从而诱发一系列病毒病害症状的产生。以Fibrillarin基因沉默后的烟草植株为材料,研究揭示Fibrillarin基因的沉默不会影响RDV Pns11的定位;然而,RDV Pns11的RNA沉默抑制活性可能依赖于核仁蛋白-Fibrillarin,推测Pns11可能与Fibrillarin或Fibrillarin基因下游的某些基因存在互作。
　　 水稻矮缩病毒和水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)同属植物呼肠孤病毒属成员,且RDV Pns11与RGDV Pns12在氨基酸序列结构上存在22％的相似性。利用农杆菌共浸润的方法发现RGDV Pns12蛋白是该病毒的第二个RNA沉默抑制因子。Pns12能够抑制正义链RNA诱发的局部沉默,但不能抑制由双链RNA诱发的局部沉默,在异源病毒表达载体PVX中,Pns12能够增强PVX对本氏烟草的致病性。其结果表明,Pns12蛋白为RNA沉默抑制因子,可能作用于RNA沉默路径中dsRNA形成的上游,这与RDV Pns11具有RNA沉默抑制功能的研究结果是一致的。此外对RGDV Pns12亚细胞定位结果也显示,RGDVPns12和RDV Pns11的定位形式也是相似的,主要定位于烟草表皮细胞的细胞核和核仁中,推测该基因可能在细胞核或核仁中发挥功能。