卵巢子宫内膜异位囊肿继发卵巢纤维化的机制研究

摘要

卵巢子宫内膜异位囊肿，又称巧克力囊肿，简称巧囊，是一种具有“恶性行为”的良性疾病，它会造成盆腔粘连、排卵障碍、卵子生成障碍、影响胚胎种植等，从而引起不孕。大多数学者认为卵巢子宫内膜异位囊肿会降低IVF周期中卵巢对促排卵药物的反应，使药物用量增加，发育卵泡数减少，获卵数减少。本研究通过统计分析近5年在本院生殖中心行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer，IVF-ET)的盆腔子宫内膜异位症患者，比较伴与不伴卵巢子宫内膜异位囊肿对卵巢储备功能、获卵数、受精率、卵裂率、胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率及流产率的影响，分析卵巢子宫内膜异位囊肿患者影响其IVF治疗结局的因素，并建立预测模型。
　　卵巢纤维化主要表现为卵巢包膜增厚、间质纤维结缔组织增多，卵泡减少或消失。研究发现卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁的纤维化程度要明显高于卵巢畸胎瘤，纤维化相关指标如胶原蛋白Ⅰ型(collagenⅠ，ColⅠ)、肌动蛋白α(Alpha-smoothmuscle actin，α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases2， MMP2)、基质金属蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases1， TIMP1)和TIMP2等表达要显著性高于成熟畸胎瘤囊壁。
　　研究进一步检测了转化生长因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）在卵巢子宫内膜异位囊肿壁的表达，同时发现子宫内膜异位细胞能特异合成TGF-β1。通过体外培养子宫内膜来源的干细胞，评估TGF-β1对子宫内膜来源的干细胞纤维化的作用，并检测TGF-β1/Smad通路中的相应因子的变化，从而探索卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁纤维化的可能机制。另外，本研究发现卵巢子宫内膜异位囊肿患者的卵丘颗粒细胞凋亡率明显升高，并对卵巢子宫内膜异位囊肿患者成熟卵泡的卵泡液行microRNA高通量测序，发现有7个let-7家族明显上调，并探索TGF-β1与let-7家族的关系，证实了卵巢子宫内膜异位囊肿卵泡微环境的改变，推测了卵母细胞质量下降的可能原因。
　　第一部分卵巢子宫内膜异位囊肿合并不孕患者行IVF-ET治疗结局影响因素探讨——五年数据分析
　　目的:
　　比较卵巢子宫内膜异位囊肿与其他盆腔子宫内膜异位症患者的卵巢储备功能，以及对IVF-ET治疗的获卵率、受精率、优胚率以及妊娠结局的影响，并探讨影响卵巢子宫内膜异位囊肿患者IVF-ET治疗结局的主要因素，为临床诊疗提供一定的参考。
　　材料与方法:
　　选取2011年1月至2015年12月因盆腔子宫内膜异位症在我院生殖中心行IVF-ET的≤38岁患者共619例，其中卵巢子宫内膜异位囊肿患者398例，其他盆腔子宫内膜异位症221例。
　　所有IVF-ET周期均行促排卵治疗，卵母细胞收集后2～6小时内完成授精。胚胎评分系统按卵裂球质量和对称性分为4级。胚胎冻融技术在2011～2012年均采用经典TESTART's慢速冷冻和快速复苏方法，2013年开始逐渐采用玻璃化冷冻和解冻。
　　鲜胚移植在取卵后3天评估胚胎质量和患者情况，每周期移植胚胎数≤3个，胚胎常规移植于官腔中段。冷冻胚胎移植内膜准备分为自然周期、小剂量Gn促排周期以及激素替代周期。胚胎移植后第12天血β-hCG检测确定是否妊娠，移植后第35天B超检查见孕囊定义为临床妊娠。
　　使用SPSS20.0统计学软件分析数据，用单样本Kolmogorov-Simimov检验有无正态分布，计量资料用平均值±标准差（X±S）表示，采用t检验比较，计数资料使用x2检验进行统计分析，理论频数＜1时，采用Fisher确切概率法;相关性分析采用Spearman秩相关分析，初步筛选出可能对卵巢子宫内膜异位囊肿患者的IVF-ET治疗结局有意义的参数;以是否妊娠为因变量(Y=0，1)，以初步筛选的参数为自变量，采用逐步回归法建立二项分类Logistic回归模型筛选出有意义的因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、卵巢子宫内膜异位囊肿组的不孕年限少于其他盆腔子宫内膜异位症，差异有统计学意义(P＜0.01);卵巢子宫内膜异位囊肿组的窦卵泡数少于其他子宫内膜异位症，两个年龄组差异均有统计学意义(P＜0.01);≤30岁的基础FSH两组无差异，但31～38岁组的基础FSH卵巢子宫内膜异位囊肿组要明显高于其他盆腔子宫内膜异位症组(P＜0.05)。
　　2、IVF-ET治疗中，≤30岁组和31～38岁组的卵巢子宫内膜异位囊肿组的获卵数、2PN胚胎数(P＜0.01)，≤30岁组的2PN优胚数(P＜0.05)都要少于其他盆腔子宫内膜异位症组，且差异有统计学意义;两组的受精率、卵裂率、2PN优胚率均无差异;胚胎种植率、临床妊娠率及流产率两组也均无差异。
　　3、卵巢子宫内膜异位囊肿患者中首次移植成功组与治疗失败组（包括首次移植后未妊娠与无胚胎可移）相比较，妊娠组的窦卵泡数、获卵数、2PN胚胎数、2PN优胚数明显多于治疗失败组(P＜0.01)，基础FSH低于治疗失败组(P＜0.05)，且差异有统计学意义。将各参数与治疗有无成功行Pearson相关分析，不孕年限、窦卵泡数、获卵数、2PN胚胎数与2PN优胚数均与治疗有无成功相关，除不孕年限仅与2PN优胚数相关外，余各因素间都存在相关性。将这5个因素采用逐步回归法建立二项分类Logistic回归模型，窦卵泡数与2PN优胚数是卵巢子宫内膜异位囊肿患者IVF-ET是否成功的关键因素。将2个关键因素及其彼此的回归系数建立预测卵巢子宫内膜异位囊肿患者IVF-ET治疗结局的概率模型:P=1/1+exp（0.870-0.088×（窦卵泡数）-0.432×（2PN优胚数）），绘制此模型预测率的受试者工作特征(ROC)曲线，模型ROC曲线下面积为0.734，有统计学意义(P＜0.01)，其95％可信区间为(0.684～0.783)。
　　4、卵巢子宫内膜异位囊肿手术组有383例，非手术组15例，两组平均年龄无显著差异，手术组术前卵巢子宫内膜异位囊肿直径明显大于非手术组(4.1cmvs.2.2cm，P＜0.001)，手术组的窦卵泡数明显多于非手术组(6.9 vs.5.5，P=0.017)，手术组的获卵数、胚胎数、优胚数均多于非手术组，但差异无统计学意义，可能与非手术组例数过少以及两组术前状态差异有关。
　　结论:
　　子宫内膜异位症会降低IVF-ET的治疗结局，但如存在卵巢子宫内膜异位囊肿会明显降低卵巢储备功能从而影响IVF-ET治疗的结局。卵巢子宫内膜异位囊肿本身还是手术本身更不利于卵巢储备功能目前尚无定论，卵巢子宫内膜异位囊肿患者需要根据年龄、卵巢功能、是否生育、卵巢囊肿大小等尽早制定治疗方案，尽可能保护卵巢功能。
　　第二部分卵巢子宫内膜异位病灶周围卵巢组织纤维化及其机制研究
　　目的:
　　研究通过比较卵巢子宫内膜异位囊肿和成熟畸胎瘤的囊肿壁的组织学特点以及分子学特征，周围卵巢组织的纤维化程度，提出卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁为内异病灶周围卵巢组织纤维化形成的假说，并探索TGF-β1在卵巢子宫内膜异位病灶的表达及其周围卵巢组织纤维化的作用。
　　材料与方法:
　　1、本研究共招募了2014年11月至2015年12月间71例因卵巢囊肿入院行腹腔镜手术患者，其中卵巢子宫内膜异位囊肿42例，成熟畸胎瘤29例。所有患者均行腹腔镜下卵巢囊肿剥除术，术后用剪刀获取囊肿壁上约1×1 cm2的组织，行HE染色体和Masson染色观察囊壁纤维化程度。
　　2、采用RT-qPCR检测囊壁组织的ECM沉积和降解平衡指标如TIMP1、TIMP2、MMP2纤维化相关指标包括Co1Ⅰ、α-SMA、CTGF等;通过IHC和Western Blotting检测比较TGF-β1在卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁和成熟畸胎瘤囊壁上的表达。
　　3、通过FISH检测卵巢子宫内膜异位囊肿中TGF-β1 mRNA的合成部位。
　　4、采用RT-qPCR检测了卵巢子宫内膜异位病灶的紧邻与远离卵巢组织TGF-β1及其他纤维化相关基因。
　　结果:
　　1、相同临床特征的患者卵巢子宫内异囊肿囊壁较成熟畸胎瘤囊壁纤维化明显，HE染色及Masson染色可看到更多的纤维化表现。RT-qPCR检测发现卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁中，ECM沉积和降解平衡指标如TIMP1、TIMP2、MMP2以及纤维化相关指标包括ColⅠ、α-SMA、CTGF等表达显著性高于成熟畸胎瘤囊壁。
　　2、TGF-β1特异性表达在卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁子宫内膜异位细胞中，而成熟畸胎瘤囊壁以及紧靠囊腔表面的上皮细胞均不表达TGF-β1;卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁的TGF-β1蛋白表达水平明显高于成熟畸胎瘤囊壁;FISH检测也提示子宫内膜异位细胞可特异性合成TGF-β1。
　　3、紧邻卵巢子宫内膜异位病灶的卵巢组织TGF-β1较远离病灶的卵巢组织表达升高，ColⅠ、α-SMA、CTGF表达亦升高(P＜0.01)，差异均有统计学意义，纤维化程度升高，说明与卵巢子宫内膜异位病灶相邻越近，卵巢组织纤维化程度越显著，推测卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁为高度纤维化的卵巢组织形成。
　　结论:
　　卵巢子宫内膜异位囊肿的子宫内膜异位细胞合成和分泌TGF-β1，并积聚于周围的卵巢组织，打破细胞外基质沉积与降解平衡，导致周围卵巢组织纤维化形成囊壁及与邻近卵巢组织粘连形成。由于粘连形成，在囊肿剥除手术中容易带走正常卵巢组织，从而进一步降低卵巢储备功能。因此，如何保护卵巢功能是目前卵巢子宫内膜异位囊肿治疗的争论焦点之一。阻断病理性的TGF-β1表达，抑制内异病灶周围的卵巢组织纤维化形成是研究的主要方向之一。
　　第三部分卵巢子宫内膜异位病灶继发卵巢纤维化影响卵泡徼环境的作用途径探索
　　目的:
　　本研究探索TGF-β1/Smad通路的激活在卵巢子宫内膜异位病灶周围卵巢组织纤维化进程中的作用，并通过体外试验来验证TGF-β1引起纤维化的作用途径。另外研究还结合子宫内膜异位症患者卵丘颗粒细胞凋亡率升高的现象，从分子和基因层面研究TGF-β1升高与卵泡微环境改变的可能关系，为这类患者卵巢功能的保护性治疗提供实验基础和思路。
　　材料与方法:
　　1、将卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁样本行HE染色，Masson染色和免疫组化检测，检测TGF-β1以及TGF-β1/Smad通路上各因子的表达。
　　2、本研究获取在我院生殖中心&妇产科行子宫切除术或子宫内膜活检术患者的子宫内膜，经过对子宫内膜来源的干细胞的分离、培养和鉴定，将干细胞与10ng/ml TGF-β1共培养，检测干细胞上纤维化指标及TGF-β1/Smad通路的组成部分相关因子的表达。
　　3、获取卵巢子宫内膜异位囊肿合并不孕以及管性因素行IVF-ET的患者的卵丘颗粒细胞，测定并比较颗粒细胞凋亡率，明确卵巢子宫内膜异位患者卵泡微环境的改变。
　　4、获取来自于6例行IVF治疗的患者的卵泡液，其中3例为卵巢子宫内膜异位囊肿患者，另3例为输卵管梗阻患者，提取RNA后行microRNA高通量测序。
　　5、根据microRNA高通量测序结果，选择293T细胞与TGF-β1+/-TGF-β1抑制剂SB-431542共培养，RT-qPCR测定let-7家族microRNA的变化。
　　结果:
　　1、将卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁样本行HE染色，Masson染色和免疫组化检测。结果发现:TGF-β1，TGF-βR1，α-SMA，ColⅠ和CTGF免疫组化染色阳性表达区域，与Masson染色纤维化区域相同。同时，P-Smad2、P-Smad3，Smad2/3、Smad2、Smad3和Smad4的表达区域与TGF-β1，TGF-βR1，和纤维化表达区域相同。
　　2、体外培养子宫内膜细胞来源的干细胞，通过添加TGF-β1共培养后，发现干细胞中的纤维化相关因子如ColⅠ、αSMA，CTGF和FN基因表达增加，并与作用时间呈正相关;同时，ColⅠ、CTGF、αSMA和MMP2的蛋白表达亦增加，与作用时间也呈正相关。此外，TGF-β1/Smad通路中的相应因子，如Smad2、P-Smad2、Smad3、P-Smad3被激活，在TGF-β1作用初始阶段即升高。
　　3、卵泡液microRNA（简称miRNA）高通量测序提示卵巢子宫内膜异位囊肿患者卵泡液中miRNA let-7家族共有7个miRNA，分别为hsa-let-7f-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7g-5p和hsa-let-7c-5p，表达较管性因素者显著上调。分析文献，发现let-7g可以诱导卵巢颗粒细胞凋亡率升高，使卵泡闭锁，改变卵泡微环境。
　　4、卵巢子宫内膜异位囊肿组的年龄与管性因素组无明显差异，但获卵数要明显少于管性因素组，卵丘颗粒细胞的凋亡率要明显高于管性因素组(37.2％vs.9.2％)，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　5、仅TGF-β1处理后293T细胞let7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和miRNA-98表达均显著上调，而经过TGF-β1抑制剂SB-431542作用后，let7家族上调被抑制，说明TGF-β1可能参与了let7家族的表达上调。
　　结论:
　　TGF-β1/Smad信号通路在卵巢子宫内膜异位病灶周围卵巢纤维化形成中发挥着重要作用。通过对卵泡液microRNA高通量测序分析发现，卵泡液中有7个let-7miRNA表达异常上调;进而推测卵巢纤维化过程中TGF-β1信号通路激活开放，上调了let-7家族，使卵丘颗粒细胞的凋亡率升高，改变了卵泡微环境，阐明了一种因子宫内膜异位细胞合成TGF-β1引起卵巢组织纤维化导致卵泡微环境改变的作用机制，为改善卵母细胞质量治疗提供了可能的作用靶点。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

缩略词表

第一部分 卵巢子宫内膜异位囊肿合并不孕患者行IVF-ET治疗结局影响因素探讨——五年数据分析

1．1 引言

1．2 资料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二部分 卵巢子宫内膜异位病灶周围卵巢组织纤维化及其机制研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第三部分 卵巢子宫内膜异位病灶继发卵巢纤维化影响卵泡微环境的作用途径探索

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

全文结论与创新点

附录

综述 卵巢纤维化的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果