人类瓣状核酸内切酶FEN1底物识别及甲基化调控的机制研究

摘要

人类瓣状核酸内切酶1(Flap endonuclease1，FEN1)属于结构特异性核酸酶，具有5'分枝核酸内切酶(FEN)，5'核酸外切酶(EXO)和缺口核酸内切酶(GEN)活性，是一类非常保守的蛋白酶。在人类细胞中，FEN1蛋白介导了基因组复制中冈崎片段的成熟，同时也参与了损伤DNA碱基切除修复途径，对于维持细胞基因组稳定性至关重要。由于FEN1具有剪切DNA的活性，因而该核酸酶在细胞中的定位、表达和活性需要被精准的调控，其功能的缺陷将造成DNA复制和修复的异常，进而导致癌症等疾病的发生。目前的研究表明，对于FEN1蛋白的调控至少包括2个层面，即其本身的底物识别机制以及蛋白质翻译后修饰(Post-translational modifications, PTMs)的调控。
　　FEN1蛋白在体外具有比较弱的核酸外切酶活性，然而其在细胞中行使功能主要依赖于核酸内切酶活性。生化实验研究表明底物双分枝DNA(double flapDNA)是FEN1蛋白的最适底物，除了能够高效的识别5'分枝双链DNA之外，3'分枝DNA则能够大大的增强其核酸内切酶活性。关于FEN1蛋白具体的底物识别切割过程，目前主要有两种不同的观点:第一种观点认为FEN1蛋白首先识别5'分枝DNA，然后沿着单链DNA滑动至双链部分后行使酶切功能(trackingmodel);另一种观点则认为在FEN1蛋白结合双链DNA之后，5'分枝DNA才进入活性中心被切割(threading model)。尽管这两种模型都有一定的证据支持，但目前仍然缺乏直观的证据。另外一方面，翻译后修饰对FEN1蛋白活性的调控是目前研究的热点。细胞内FEN1蛋白具有甲基化、磷酸化、泛素化等多种PTMs类型。体内外研究表明FEN1蛋白的细胞定位和活性受其甲基化和磷酸化修饰的严格调控。192位点精氨酸的甲基化修饰能够增强FEN1蛋白与PCNA、WRN等支架蛋白的互作，为其细胞定位和招募所必须。187位点的磷酸化修饰则能够使FEN1蛋白从复制叉解离，并激活后续的多聚泛素化降解。有意思的是这两种修饰类型并非孤立，甲基化修饰极大的抑制了FEN1蛋白的磷酸化修饰水平，但具体的机制目前仍不清楚。
　　本论文利用分子生物学、生物化学以及结构生物学方法，研究FEN1蛋白的调控机制。通过使用野生型、活性位点突变(D181A，能够结合但不能酶切底物)和模拟持续甲基化的FEN1蛋白(R192F)，筛选不同的底物双分枝DNA进行共结晶，成功解析了人类FEN1-DNA的二元复合物的晶体结构。同时结合体外酶动力学和western blot实验，阐明了其底物识别和甲基化调控的机制。具体结果如下:
　　1.成功表达、纯化了全长和截短的人类FEN1蛋白并得到了FEN1-DNA复合体的晶体(1.9-2.3(A));使用分子置换法完成了结构的解析。
　　2.分子结构显示野生型的FEN1蛋白由于并未结合底物DNA(apo结构)，其参与底物结合的蛋白质区域在晶体内为无序状态，这与已发表的FEN1蛋白结构一致。活性中心的两个催化金属镁离子分别与保守的酸性氨基酸和水分子结合，表明其为一个双金属离子催化的核酸酶。
　　3.在活性位点突变(D181A)的FEN1-DNA复合体结构中首次观察到了完整的5'分枝DNA(pre-cleavage complex)，表明FEN1蛋白行使酶切功能首先需要识别双链DNA，为“threading”模型提供了直接的结构生物学证据。同时47位点的精氨酸不仅维持了“螺旋门”(helical gateway)的稳定，还参与了5'分枝DNA的结合。
　　4.模拟持续甲基化(R192F)的FEN1-DNA复合体具有与野生型几乎完全相同的分子构象和活性中心(product complex)，表明FEN1蛋白在细胞内的甲基化并不影响其生化活性，与体外的酶动力学实验结果一致。192位点的突变使下游重要的DNA结合元件β-pin由loop区域变成了α-螺旋，进而影响了其与磷酸激酶的互作，揭示了甲基化修饰抑制FEN1磷酸化水平的分子机制。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

主要缩略词

1 文献综述

1．1．2 FEN1在DNA损伤修复中的作用

1．2 FEN1的生化活性研究

1．2．1 FEN1的核酸酶活性研究

1．2．2 FEN1的互作蛋白研究

1．3 FEN1的结构生物学研究

1．3．2 FEN1的底物识别机制研究

1．4 蛋白质的翻译后修饰

1．4．1 翻译后修饰的类型

1．4．2 FEN1的翻译后修饰研究

1．5 FEN1的应用

1．6 本章小结

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．3 菌株、酶、标准品以及试剂盒

2．1．4 常用纯化色谱柱

2．1．5 常用晶体筛选试剂盒

2．1．6 FEN1的克隆与DNA的合成

2．2 实验方法

2．2．1 双分枝DNA的制备

2．2．2 分子生物实验

2．2．3 酶动力学实验

2．2．4 蛋白质-DNA的共结晶

2．2．5 Western-blot检测目的蛋白

3 DNA的制备、FEN1的纯化及生化活性分析

3．1 结晶用DNA的制备砒

3．2．1 FEN1蛋白的表达

3．2．2 FEN1蛋白的可溶性

3．2．3 FEN1蛋白的纯化

3．3 FEN1蛋白的生化活性

3．4 本章结论

4 晶体制备及结构解析

4．1 共结晶底物双分枝DNA的优化

4．2 晶体的生长

4．3 本章讨论

5 FEN1-DNA复合体的结构

5．1 FEN1蛋白的总体结构

5．2 5’分枝DNA的构象

5．3 活性中心和催化机制

5．4 甲基化修饰的调控机制

5．5 本章讨论

6 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

附录

博士期间发表的论文