热带睡莲胆碱氧化酶基因CodA的转化及其耐寒生理研究

摘要

睡莲属于睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)，是多年生水生草本植物，含热带睡莲和耐寒睡莲两个生态类型。热带睡莲从观赏价值到经济价值都高于耐寒睡莲，但是由于热带睡莲在北亚热带及以北地区不能露地越冬，严重影响了热带睡莲的应用价值，所以如何提高热带睡莲的耐寒性达到延长花期和露地越冬是北亚热带及以北地区热带睡莲育种研究的首要目标。通过传统杂交育种方法难以解决提高热带睡莲耐寒性和露地越冬的问题。而现代分子生物学和基因工程等技术方法的快速发展为其提供了新的思路和方法。
　　论文首先针对睡莲育苗中遇到的问题进行了系统研究和实践，特别是在基质处理、病虫害防治和水生杂草的去除方面积累了丰富的经验，形成了一套完善的热带睡莲种子繁殖体系，显著提高了热带睡莲的成苗率。
　　本研究查清了影响花粉管通道法转化效率的各影响因素，建立了热带睡莲花粉管通道转化法的转基因体系，即在热带睡莲开花第一天，用浓度为OD600=0.7的农杆菌侵染热带睡莲，种子成熟后，用10mg·L-1的潮霉素筛选溶液进行种子萌发培养和筛选。
　　通过花粉管通道法成功地将胆碱氧化酶基因（CodA）转入热带睡莲中，筛选得到的抗性植株经育苗后进行大田种植，经过2015-2016年杭州露地越冬（最低气温-8.9℃）抗冻试验后，获得了12株转基因热带睡莲株系。经PCR检测，证实CodA基因已经整合到热带睡莲基因组中，RT-PCR检测其中2株低温胁迫前后转基因植株，证实CodA基因在低温胁迫下能正常表达。通过对3个热带睡莲转基因株系低温胁迫后的生理生化分析，发现低温胁迫后转基因植株的甜菜碱含量、SOD，CAT和POD活性显著高于对照植株，电导率和MDA含量显著低于非转基因植株。说明在低温冻害时，转基因植株通过外源CodA基因的表达增强体内甜菜碱的合成，从而提高其耐寒性。
　　选取4个转基因株系和浙江人文园林有限公司培育的优良单株40个株系为亲本，共做了164个杂交组合，收到果实组合数为79个。2016年夏天播种10个组合，将其中144株睡莲苗在大田进行露地越冬抗冻试验，其中有5株能在杭州露地越冬。
　　本研究建立了热带睡莲花粉管通道法转基因体系，获得了一批能在杭州露地越冬的转基因株系和转基因杂交后代，为解决在温带地区热带睡莲露地自然越冬问题奠定了坚实基础，同时也将推动热带睡莲基因工程的发展。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 睡莲的分类

1．2 睡莲的生物学特性

1．3 睡莲分布

1．4 睡莲栽培

1．5 睡莲分子生物学研究

1．6 睡莲的形态学研究

1．7 睡莲的药理学研究

1．8 睡莲应用

1．9 睡莲育种的历史、现状与发展

1．10 花粉管通道法转基因的研究进展

1．11 甜菜碱相关研究进展

1．12 本研究的目的和意义

2 睡莲种子繁殖体系研究

2．1 引言

2．2 睡莲种子繁殖体系

2．3 讨论

3 热带睡莲花粉管通道转化体系的构建

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．4 结果与分析

3．5 讨论

4 基于花粉管通道法的热带睡莲耐寒转基因

4．1 引言

4．2 试验材料

4．3 试验方法

4．4 结果与分析

4．5 讨论

5 转基因植株耐寒性研究

5．1 引言

5．3 试验方法

5．4 结果与分析

5．5 讨论

6 转基因植株杂交后代耐寒性情况

6．1 引言

6．3 试验方法

6．4 结果与分析

6．5 讨论

7 结论、创新点和展望

7．1 主要结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

致谢