准噶尔盆地鼠疫自然疫源地动物鼠疫流行的时空分布及鼠疫菌重要功能蛋白的克隆表达

摘要

目的：了解和掌握准噶尔盆地鼠疫自然疫源地动物鼠疫流行的空间及时间分布；利用DNA重组技术，获得融合表达的鼠疫菌重要功能蛋白，为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定基础。
　　方法：采用统计学方法分析准噶尔盆地鼠疫自然疫源地2005～2012年的大沙鼠血清鼠疫抗体检测数据，并结合准噶尔盆地地理地貌特征，分析其抗体阳性率在空间区域尺度和年时间尺度上的变化；根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白，即caf1、ph6和YopD蛋白（caf1、ph6去除信号肽），利用分子克隆技术克隆后，在原核系统中进行表达。
　　结果：我们共采集准噶尔盆地13个行政区域大沙鼠血清数据4825份。结果表明，在空间区域尺度上，大沙鼠动物鼠疫流行存于准噶尔盆地中东部的古尔班通古特沙漠荒漠和准噶尔盆地西部低山平原粘土荒漠2个地区，前者大沙鼠鼠疫抗体阳性血清分布占采集地区的83.3％，血清平均阳性率为8.39%，后者阳性血清分布仅占采集地区的1/3，阳性率为1.56%；在年时间维上，准噶尔盆地西部地区呈现下降趋势，大沙鼠血清鼠疫抗体阳性率由2005年的7.59%下降至2008年的0.61%，其后一直处于静息状态。而在古尔班通古特沙漠荒漠地区，东、中、西3个区段的大沙鼠血清鼠疫抗体阳性率的变化则有所不同，西部地区于2006年和2010年间出现2次流行高峰，高峰间隔期为4年，2010年高峰期的阳性率则达45.65%，为3个地理区段最高值。中部地区于2006、2009和2011年出现3次高峰，高峰间隔期为2.5年，平均阳性率8.92%，流行强度低于东、西部。东部地区是大沙鼠鼠疫最活跃的地区，各年度均可检出鼠疫抗体阳性血清，血清阳性率的变化呈现2006、2009和2012年3个高峰期，高峰间隔期为3年；在季节时间维上，秋季大沙鼠血清鼠疫抗体阳性率大于春季，说明大沙鼠鼠疫流行为春季至秋季的持续流行；在大肠杆菌中成功获得了三种融合表达蛋白，即重组 caf1、重组 ph6和重组 YopD。
　　结论：准噶尔盆地的大沙鼠鼠疫流行存在地理区域上和时间上的双重波动，及地理区域上的异质性，可分为准噶尔盆地西部低山平原粘土荒漠和中东部古尔班通古特沙漠荒漠2个流行区域。因此，为能及时发现该疫源地动物鼠疫疫情、及时控制疫情，鼠疫监测工作宜采取点面结合的方式，满足地域上覆盖的广泛性和时间上的持续性。经反复摸索诱导条件后，以质粒pET-32a（+）作为表达载体，目的蛋白caf1、ph6和YopD均能在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中稳定高效地表达。

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前言

研究内容与方法

1 实验材料

1.1 试验用血清

1.2 鼠疫菌DNA模板

1.3 试剂及试剂盒

1.4 工具酶、DNA分子量标准和蛋白质分子量标准

1.5 主要仪器设备

1.6 载体质粒及基因工程菌

2 实验方法

2.1 F1抗体检测方法

2.2 区域划分方法

2.3 鼠疫相关蛋白的选取

2.4 重组表达质粒的构建

2.5 阳性克隆子的筛选与鉴定

2.6 重组蛋白的诱导表达

2.7 电泳分析

3 质量控制

3.1 实验前期的质量控制

3.2 实验过程中的质量控制

3.3 实验结束后的质量控制

4 数据分析

5 技术路线

结果

1 准噶尔盆地鼠疫自然疫源地动物鼠疫流行的时空分布

1.1大沙鼠血清地理分布组成

1.2 大沙鼠血清鼠疫抗体的空间和时间三维分布

1.3 大沙鼠鼠疫抗体携带率的地区和季节分布

2 鼠疫菌重要功能蛋白的克隆表达

2.1 目的基因的扩增产物

2.2 重组质粒的酶切鉴定

2.3 重组质粒的序列分析鉴定

2.4 重组鼠疫相关蛋白诱导表达结果

讨论

小结

致谢

参考文献

附录1

附录2

附录3

综述

攻读硕士学位期间发表的学术论文

个人简历

新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表