C57小鼠脂肪源间充质干细胞在体外促进造血干细胞的扩增

摘要

目的：探讨C57小鼠脂肪源间充质干细胞在体外对小鼠造血干/祖细胞扩增的影响。
　　方法：无菌条件下获取C57BL/6小鼠的脂肪源干细胞（ADSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs），培养至P3代：细胞形态学分析；流式细胞术检测细胞表面免疫表型；脂肪源干细胞定向成骨、成脂、成软骨细胞诱导。将小鼠脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞经丝裂霉素C处理后作为滋养层，以C57小鼠造血干细胞Lin-Sca-1+C-kit+（LSK）作为长期培养起始细胞（LTC-IC），对其进行35天长期体外共培养，将本实验分3组：A组：LSK加小鼠脂肪源细胞，B组：LSK加骨髓间充质干细胞（BMSCs），C组：LSK单独培养；分别于0 d、14d、35d观察造血集落生长、流试分析、甲基纤维素14 d处理分析造血干/祖细胞集落增殖状态；利用扫描电镜检测与ADSCs或BMSCs饲养层共培养2周或5周的LSK细胞的形态；同时应用荧光定量PCR计数检测共培养后LSK的Notch信号相关基因Jagged-1、Jagged-2、Notch1、Notch2的mRNA表达水平。
　　结果：1 ADSCs、BMSCs的生物学分析：ADSCs、BMSCs在体外呈梭形生长并可稳定传代；成骨、成脂、成软骨诱导均为阳性；流式结果分析ADSCs与BMSCs均表达CD29、CD105、Sca-1，均不表达CD34、CD133，但 BMSCs高表达 CD45。2细胞体外二维共培养后对 LSK扩增的影响：①ADSCs可以有效促进LSK细胞体外扩增；②扫描电镜显示粘附在饲养层上的LSK细胞显示出了不同的形态;③ADSCs饲养层可以影响LSK细胞的Notch相关基因的表达。
　　结论：C57小鼠脂肪源间充质干细胞在体外可以有效地促进LSK的扩增，并对LSK细胞的Notch相关基因的表达产生影响。

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前言

内容与方法

1 材料

1.1 主要设备

1.2 主要试剂

1.3 实验动物

1.4 主要试剂的配制方法

2 实验方法

2.1 小鼠脂肪源干细胞的获取

2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的获取

2.3 脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞饲养层制备

2.4脂肪源干细胞和骨髓间充质干细胞表面标记物的检测

2.5脂肪源干细胞和骨髓间充质干细胞的生长动力学和周期的检测

2.6 脂肪源干细胞和骨髓间充质干细胞的多向分化能力检测

2.7 小鼠造血干细胞（Lin-Sca-1+C-kit+，LSK）的分选

2.8 脂肪源干细胞、骨髓间充质干细胞、LSK在体外的共培养

2.9 LSK共培养与脂肪源干细胞、骨髓间充质干细胞共培养后扫描电镜检测

2.10与脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞共培养后的LSK的Notch相关基因的实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测

3技术路线图

4统计学分析

结果

1 小鼠脂肪源干细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性

1.1 ADSCs与BMSCs的形态学特点

1.2 ADSCs和BMSCs的生长曲线和细胞周期

1.3 ADSCs和BMSCs的流式细胞术检测

1.4 ADSCs与BMSCs细胞克隆形成能力

1.5 ADSCs与BMSCs多向分化潜能

2 小鼠脂肪源干细胞、骨髓间充质干细胞与LSK细胞在体外长期共培养

2.1 小鼠ADSCs、BMSCs对LSK体外扩增的影响

2.2 小鼠ADSCs、BMSCs与LSK细胞体外共培养的扫描电镜分析

3 与小鼠脂肪源干细胞与骨髓间充质干细胞饲养层共培养 LSK 细胞相关基因的实时荧光定量聚合酶链反应检测

3.1 共培养后对LSK细胞的Jagged-1、Jagged-2基因mRNA表达水平的影响

3.2 共培养后对LSK细胞的Notch-1、Notch-2基因mRNA表达水平的影响

讨论

1脂肪源间充质干细胞在体外共培养促进LSK的扩增

2脂肪源间充质干细胞在体外共培养后对LSK细胞的Notch相关基因表达的影响。

3总结与展望

小结

致谢

参考文献

综述

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