TGF-β与Th类细胞因子“对话”在泡球蚴感染所致宿主病理损伤作用机制研究

摘要

目的：探讨TGF-β与Th类细胞因子的“对话”在泡球蚴感染所致宿主病理损伤中的作用。
　　方法：⑴肉眼直视下肝脏穿刺建立泡球蚴感染小鼠模型：8-10周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为实验组和对照组。乙醚麻醉，实验组开腹直视下肝左叶注射0.1mL泡球蚴混悬液，丝线缝合关闭腹腔。对照组相同部位注射等量生理盐水。感染2、8、30、60、90、180、270、360天处死小鼠，两组均在肝左叶相同部位采集标本；⑵采用36k小鼠全基因组寡核苷酸芯片分析 BALB/c小鼠肝泡球蚴感染动物模型，肝脏基因mRNA转录本含量的改变；确定目标基因并联机检索GeneBank等整合数据库，按其生物功能进行分类。应用Gene Cluster3.0生物信息可视化分析软件进行等级聚类分析。筛选肝脏免疫相关基因；⑶泡球蚴病人和泡球蚴感染小鼠肝脏组织，福尔马林固定、石蜡包埋，4μm连续切片。HE染色观察病理变化，免疫组化方法、Western Blot和实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、Smads、MAPK、肝细胞增殖和凋亡相关蛋白及mRNA的表达与分布，原位末端标记技术（TUNEL）检测病灶肝细胞凋亡；⑷原位肝脏灌注法分离大鼠肝细胞，与泡球蚴囊液共培养，15min、30min、1h、2h、24h收集细胞，Western Blot检测TGF-β1、Smads、MAPK相关蛋白的表达。
　　结果：⑴随着泡球蚴感染时间的延长，肝损伤逐渐增加，肝纤维化程度增加，TGF-β1在泡球蚴感染所致的肝纤维化中具有促进作用；⑵泡球蚴感染早期以Th1免疫反应为主，感染中期呈现出混合的Th1/Th2免疫反应，感染晚期免疫反应降低，化学趋化因子在泡球蚴感染过程中发挥着重要的作用，病灶旁肝组织促进了细胞因子和化学趋化因子的产生和活性；⑶在泡球蚴感染早期，IL-17A和IL-17F在病灶炎性带组织和病灶旁肝组织中均高表达，感染晚期 IL-17A表达低于对照组，而IL-17F的表达虽有所降低，但仍高于对照组；⑷泡球蚴感染激活宿主肝细胞TGF-β/Smad信号通路，造成了肝纤维化；⑸在泡球蚴感染的早期，以ERK1/2信号通路被激活，促进肝细胞的增殖；在感染的中期，以Gadd45β高表达，调控肝细胞的抗凋亡；在感染的晚期，以细胞凋亡蛋白p53、p21高表达，肝细胞发生生长抑制或凋亡。
　　结论：⑴泡球蚴感染TGF-β高表达，引起机体免疫抑制状态的形成，造成泡球蚴的“免疫逃避”，同时导致宿主肝脏发生病理性损伤；⑵泡球蚴感染早期以Th1免疫反应为主，感染中晚期呈现出混合的Th1/Th2免疫反应，化学趋化因子在泡球蚴感染过程中也发挥着重要的作用，病灶旁肝组织促进了细胞因子和化学趋化因子的产生和活性；⑶首次证明细胞因子和化学趋化因子，尤其是IL-17，在泡球蚴感染病灶旁炎性带和病灶旁肝组织发挥着重要的作用，结果提示TGF-β对 IL-17不同的亚型表达及Treg具有调控作用，调节T细胞向特定方向分化，并诱导免疫细胞发生凋亡，从而介导泡球蚴的免疫逃避，同时造成宿主组织损伤；⑷我们的研究结果的提示，在泡球蚴感染宿主肝脏过程中，泡球蚴感染引起宿主炎症反应或泡球蚴自身，分泌TGF-β及炎症/抗炎症细胞因子，激活下游Smad信号通路，从而导致宿主肝脏发生纤维化；⑸在泡球蚴感染宿主肝脏的过程中，泡球蚴通过直接刺激（囊液中的有害成分、原头蚴本身分泌的某些成分）或间接（引起宿主免疫系统分泌的TGF-β及相关细胞因子）刺激，产生细胞毒性，造成宿主细胞应激反应，激活宿主肝细胞MAPK信号通路（ERK和JNK信号通路）和细胞周期相关调控因子，影响宿主肝细胞周期、引起宿主肝细胞增殖、生长抑制、凋亡和肝细胞功能改变等，最终导致宿主“肝肿大（感染早、中期）”或肝脏萎缩、变性甚至坏死（感染晚期）；⑹在泡球蚴感染的早期，以ERK1/2-Cyclin D1为主线的信号通路调控肝细胞的增殖；在感染的中期，以ERK1/2-Gadd45β（Cyclin A）-PCNA为主线的信号通路调控肝细胞的抗凋亡；在感染的晚期，以p53-p21-Cyclins和p53-Gadd45γ-JNK为主线的信号通路调控肝细胞的生长抑制或凋亡，从而造成宿主病理性肝损伤。

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前言

1. AE的危害及临床表现

2. 泡球蚴免疫学研究进展及临床病例分析

3. 感染引起的炎症与纤维化之间的关系

4. TGF-β/Smads信号通路

5. MAPK信号通路

6. 我们的前期研究结果提示，泡球蚴在侵染宿主肝脏过程中通过直接和/间接的方式激活宿主肝细胞TGF-β，造成肝纤维化与肝损伤

7. 本课题的科学假说及意义

第一部分 泡球蚴感染引起宿主病理性肝损伤

1 研究材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 小 结

第二部分 TGF-β与Th类细胞因子及趋化因子在泡球蚴感染宿主病理性肝损伤中的作用机制

1 研究材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 小 结

第三部分 经典及非经典型TGF-β信号通路在泡球蚴感染引起宿主肝损伤中的作用机制研究

1 研究材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 小 结

结论

致谢

参考文献

综述

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅