构建和比较不同方法介导Gαi2C-terminal peptide转染乳鼠心肌细胞去迷走神经治疗心房颤动的研究

摘要

目的:构建携带Gαi2ctp的相关质粒和病毒，通过比较电穿孔法、腺病毒转染法和9型腺相关病毒转染法转染Giα2ctp基因至乳鼠心肌细胞，比较不同方法的转染效率、心肌毒性以及对胆碱类药物迷走效应的拮抗作用，探寻Gαi2ctp基因功能表达的最适转导途径。
　　方法:构建重组质粒pDC316-Gαi2ctp-mCMV-EGFP、重组腺病毒rAd-Gαi2ctp-mCMV-EGFP和重组9型腺相关病毒rAVV9-Gαi2ctp-IRES-EGFP以及相对应未携带Gαi2ctp的对照组。三种方法转染携带免疫荧光蛋白(EGFP)的Gi2ctp目的基因至乳鼠心肌细胞，分别找寻最佳电转参数和病毒最佳感染复数(MOI);比较最佳参数下不同方法转染情况和最大效率;AlamarBlue法测各时间点还原比率评估心肌毒性，western-blot法检测Gαi2ctp蛋白表达情况。最后分别将Gαi2ctp基因组、无基因组和空白对照组，以最适浓度的卡巴胆碱干预各组细胞，通过计数细胞整体搏动频率比较三种方法下Gαi2ctp基因的抗迷走效应差异。
　　结果:成功构建携带Gαi2ctp的真核转染质粒、rAd和rAVV9。电穿孔最佳设置为:电压:200V，脉冲时程:2ms，脉冲次数:4次/分，脉冲间隔:60s，细胞浓度:1×106/ml，质粒浓度:5ug/ml，电穿孔12h后细胞平均存活率为57.3％;rAd和rAVV9最佳MOI分别为250pfu/cell和1×107vg/cell。三种方法最佳参数下转染效率分别为:质粒组:(54.2±4.8)％于2d、rAd组:100％于1.5d和rAVV9组（59.2±4.4）％于4d;第11d转染效率分别为（30.1±6.6）％（12±3.4）％和（36±6.1）％;Western-blot法验证三组Gαi2ctp-EGFP蛋白成功表达;rAVV9组在全观察期11d内细胞活性接近空白对照组(P＞0.05)，3d后电穿孔组和rAd组细胞活性开始明显下降且后者较显著（P＜0.05）。卡巴胆碱以最佳起效浓度1μmol·L-1干预培养3d的各组细胞，发现Gαi2ctp基因组较无基因组具有明显的抗卡巴胆碱迷走效应(P＜0.05)，但Gαi2ctp基因组间比较未见明显差异（P＞0.05）。
　　结论:三种转染方法皆可有效转染乳鼠心肌细胞，但各自具有不同特点:电穿孔法转染迅速、转染效率尚可，但对细胞具有较大的破坏力;rAd法转染效率最高可达100％、但表达时间较短、心肌毒性较大;AVV9法转染起效较慢但能够稳定长时间表达且生物安全性最好。三种方法皆可有效表达Gαi2ctp并发挥拮抗迷走变时效应且各具特点，其中AVV9法更为稳定和高效。综合三种方法的有效性和毒副作用评价，AVV9法优于电穿孔法和rAd法。该实验为Gαi2ctp基因转染治疗房颤提供了可靠的理论支持和方法学依据。

目录

声明

中英文缩略词对照表

摘要

前言

实验一、pDC316-mCMV-EGFP-Gai2ctp腺病毒载体构建及包装

研究内容与方法

1．1 实验材料

1．2 pDC316-mCMV-EGFP-Gai2ctp质粒构建

1．3 PDC316-MCMV-EGFP-Gai2ctp腺病毒包装

结果

实验二、rAAV9-Gαi2ctp-IRES-EGFP质粒建构以及9型腺相关病毒包装

研究内容与方法

1．1 实验材料

1．2 rAAV9-Gαi2ctp-IRES-EGFP载体构建

1．3 rAAV-Gαi2ctp-IRES-EGFP及对照腺相关病毒包装

1．4 rAAV9-Gαi2ctp-IRES-EGFP病毒滴度测定

结果

实验三、比较不同方法携带Gαi2ctp基因转染乳鼠心肌细胞的研究

研究内容与方法

1．1 实验材料

1．2 原代乳鼠心肌细胞悬液制备和培养

1．3 质粒电穿孔转染

1．4 rAd和rAVV9病毒转染

1．5 AlamarBlue法评估三种方法的心肌毒性作用

1．6 卡巴胆碱迷走效应

1．7 Western blot检测

1．8 统计学分析

结果

讨论

小结

致谢

参考文献

综述 微创外科消融治疗心房颤动的进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

导师评阅表