绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

无浆体(Anaplasma)是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌,主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中,其引起的疾病被称为无浆体病。已知的无浆体病原包括边缘无浆体(A. marginale)、绵羊无浆体(A. ovis)、中央无浆体(A. centrale)、牛无浆体(A. bovis)、嗜吞噬细胞无浆体(A. phagocytophilum)和扁平无浆体(A. platys)。建立高效快速准确的诊断方法,对于该病的防控具有重要作用。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点,使其很快成为疾病检测和诊断的热点技术。目前,国内外均未有检测绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR方法的报道。
　　利用实验室保存的12株绵羊无浆体的gltA基因进行克隆测序。然后根据获得的绵羊无浆体和GenBank上其他相近病原体的gltA基因序列设计出针对绵羊无浆体的实时荧光定量引物和探针,建立了一种检测绵羊无浆体的实时荧光定量 PCR方法。该方法特异性强,与相近病原如边缘无浆体、牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、支原体、衣原体、螺旋体、巴贝斯虫(新疆分离株)和吕氏泰勒虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法具有较好的稳定性,组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在在0.26％-0.97%和0.42%-1.5%。对野外采集的254份山羊血液样品分别使用该方法和普通PCR方法进行检测,阳性率分别为25.6%和9.06%,结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法可以有效检测绵羊无浆体感染。
　　根据GenBank上牛无浆体及其他相近病原体16S rRNA基因序列设计出针对牛无浆体的实时荧光定量引物和探针,建立了一种检测牛无浆体实时荧光定量 PCR方法。该方法特异性好,与相近病原如边缘无浆体、绵羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、巴贝斯虫(新疆分离株)、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、支原体、衣原体、螺旋体和弓形虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法稳定性好,组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在0.10%-1.01%和0.61%-1.88%,对野外采集的196份牛和山羊血液样品分别使用实时荧光定量PCR方法和套式PCR方法进行检测,阳性率分别为62.2%和56.6%,结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的牛无浆体实时荧光定量PCR方法可以有效检测牛无浆体感染。

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第1章 无浆体病研究进展

1.1 病原学

1.2 主要表面蛋白

1.3 流行病学

1.4 诊断

1.5 预防和控制

1.6 本文的研究目的与意义

第2章 绵羊无浆体柠檬酸合酶（gltA）基因的克隆测序

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法的建立

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第4章 牛无浆体实时荧光定量PCR方法的建立

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

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