牛抗菌肽Bac7、Bac5和β防御素的研究——牛抗菌肽Bac7、Bac5和β防御素融合基因在原核、真核中的表达、纯化及抑菌活性分析

摘要

牛抗菌肽bac7、bac5是一种线性阳离子小分子多肽,牛β防御素(LAP)属于防御素类,他们在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。本研究根据Gen Bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因bat7-bac5成熟肽片段,将Bac7-Bac5片段克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于E.coli BL21(DE3)中实现了重组蛋白B7-B5(rB7-B5)的过表达,表达的rB7-B5以包涵体形式存在,rB7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6％,分子量大小为33kD,与预测大小相符。以8M尿素变性包涵体后,用Ni亲和层析柱纯化目的蛋白,经多步透析法复性的rBT-B5对金黄色葡萄球菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。 根据Gen Bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和β防御素(LAP)成熟肽基因序列,将人工合成了的牛Bac7-Bac5-β防御素基因克隆入BAC-TO-BAC(TM)重组杆状病毒表达系统的pPAST HTb载体中,构建成重组转座载体pFASTBac-B7-B5-Bβ,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含Bac7-Bac5-β防御素基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,表达量约占细胞总蛋白的10.6％,分子量大小为20kD,与预测大小相符。体外抑菌实验表明,重组的rBT-B5-Bβ蛋白具有对大肠杆菌的抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

第一部分文献综述

一抗菌肽的概念和分类

二抗菌肽特性及作用机制

2.1抗菌肽的膜活性

2.2抗菌肽的抗病毒作用及其机理

2.3抗菌肽抗寄生虫的作用及其机理

2.4抗菌肽对肿瘤细胞及癌实体瘤的作用及其机理

2.5其他的作用机制

三天蚕素，蛙皮素，蜂毒素

3.1天蚕素(cecropin)

3.2蛙皮索(magainin)

3.3蜂毒素(melittin)

四抗菌肽的研究进展

4.1转抗菌肽基因动植物的研究进展

4.2抗菌肽的表达研究进展

五存在的问题

六抗菌肽的应用前景

第二部分试验部分

试验一牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大肠杆菌中的过表达、纯化及活性分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

实验二牛抗菌肽Bac7-Bat5-β防御素串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达、纯化及活性分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

论文结论及创新点

参考文献

致谢

作者简历