牦牛源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及重组外膜蛋白OmpH、OmpA免疫效果的初步研究

摘要

目的:巴氏杆菌病主要是由特定血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurellosis multocida,Pm)引起畜禽共患的一种烈性传染病。如牛和水牛的出血性败血症,猪肺疫,兔脓血症,野生和家养鸟类的禽霍乱等。Pm给世界各地的畜牧业造成巨大的经济损失。由于其血清型较多,疫苗的免疫谱窄,保护期较短,抗菌药物效果不稳定等原因,该病仍未得到有效的控制。本研究拟从临床发病牦牛中分离鉴定多杀性巴氏杆菌,并对ompH、ompA基因序列进行生物信息学分析;原核表达、纯化OmpH、OmpA重组蛋白,免疫小鼠,观察比较两者对小鼠免疫效果。为有效控制牛巴氏杆菌病的流行和疫苗的研制提供理论依据。
　　方法:1、从临床发病的牦牛无菌采取病料,分离纯化细菌。经生化及PCR鉴定,利用PCR方法鉴定其荚膜血清型,并对其进行药物敏感性实验及小鼠半数致死量的测定。
　　2、参照GenBank中发布的ompH、ompA基因序列设计引物,扩增出ompH、ompA全长基因,将其克隆测序,利用DNAman、DNAStar等软件进行序列分析。
　　3、根据扩增的ompH、ompA全长基因设计去信号肽的ompH、ompA基因,连接至T载体,常规方法构建表达载体pET-28a-ompH、pET-28a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG进行诱导表达,大量表达并利用Ni柱纯化重组蛋白。利用Western-blot方法检测其反应原性。
　　4、将纯化的重组蛋白制备成相应的单价苗和二价苗,将重组苗及全菌灭活苗分别皮下免疫小鼠,以PBS为对照组。用ELISA检测方法评价小鼠抗体水平,三免后第9d对小鼠攻2×LD50的分离株多杀性巴氏杆菌,观察其保护性。
　　结果:1、分离得到牦牛源多杀性巴氏杆菌,药物敏感性实验表明其对庆大霉素、链霉素、四环素、土霉素、磺胺等药物敏感。其荚膜血清型为B型,小鼠半数致死量为48.3CFU/mL。
　　2、ompH、ompA基因的ORF分别为1002bp、1077bp,分别编码333、358个氨基酸,大小分别为35.6743kDa、38.3432kDa。与GenBank上公布的代表株基因的相似性分别为82.3％-99.7%、85.7%-99.7%,表明两者均具有很高的保守性。进化树分析表明两者分别与来自印度的血清型为B:2的牛源P52株多杀性巴氏杆菌的基因亲缘关系近,同源性均达99.7%。
　　3、表达载体pET-28a-ompH、pET-28a-ompA能够在大肠杆菌中高效表达。融合蛋白分子量分别约为38.0kDa、40.4kDa,经SDS-PAGE检测两者均以包涵体的形式存在。Western blot分析表明,重组蛋白能与感染分离株多杀性巴氏杆菌的小鼠产生的血清产生单一的免疫印迹条带,具有良好的反应原性。获得纯化的重组表达蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。
　　4、抗体检测发现全菌灭活组和rOmpA组抗体水平明显上升趋势,rOmpH组和rOmpH+rOmpA组抗体水平升高但效价不高,而PBS对照组抗体水平则始终维持在较低水平。全菌灭活组小鼠保护率为80%,rOmpA组小鼠保护率为40%,其他三组保护率为0%。但是,rOmpH、rOmpH+rOmpA组可推迟小鼠死亡的时间,说明其有微弱的保护力。
　　结论:本研究表明牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH和ompA基因具有很高的保守性,重组蛋白OmpH和OmpA能够刺激小鼠产生特异性抗体,重组OmpA蛋白产生的抗体对同型多杀性巴氏杆菌2×LD50的攻击具有保护力,但仍然不及全菌灭活苗,而重组OmpH蛋白产生的抗体不具有保护性。因此,多杀性巴氏杆菌亚单位苗的研制还需进一步的探究。

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主要缩略词

第一章 文献综述多杀性巴氏杆菌外膜蛋白研究进展

1外膜蛋白概况

2 外膜蛋白分类

3 Pm外膜蛋白的分类

4 Pm外膜蛋白的功能群

5 外膜蛋白作为疫苗

第二章 实验部分

实验一 牦牛多杀性巴氏杆菌分离鉴定及药物敏感试验

1 材料与方法

2结果

3 讨论

实验二 牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH和ompA基因序列分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验三 牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH、OmpA原核表达及反应原性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验四 牦牛源多杀性巴氏杆菌重组OmpH、OmpA的免疫效果初步研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 结论

创新点

参考文献

附录

致谢

研究资助

作 者 简 介