毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

摘要

目的：本研究拟通过构建结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株，初步研究其在不同培养条件下对结核分枝杆菌生存能力的影响，并对毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性相关性进行初步探讨。
　　方法：1.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建及鉴定。首先以聚合酶链反应（PCR）分别从H37Rv标准株和PUC-19K质粒上扩增出目的基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因；然后应用融合PCR技术将目的基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接，获得目的融合片段，将该融合片段克隆于pMD-19T(simple)载体形成自杀质粒pMD-19T-ΔmazEF-kan和自杀质粒pMD-19T-ΔrelBE-kan，并将自杀质粒分别转化至大肠杆菌DH5a中；最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv感受态细胞中；在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选出H37RvΔmazEF和H37RvΔrelBE缺失突变株单个菌落，提取阳性菌株全基因组DNA为模板，PCR扩增克隆片段并测序，并对所获得H37RvΔmazEF和H37RvΔrelBE缺失突变株进行遗传稳定性检测。2.结核分枝杆菌H37RvΔMazEF缺失突变株的生长表型和在不同培养条件下生存能力的初步检测。分别对野生型和缺失株进行抗酸染色，镜下观察菌株形态学的改变；分别在低氧和营养缺乏的培养基中培养缺失株和野生株，并在不同的时间点对菌落进行计数，比较野生株和缺失株在应激条件下，生存能力是否存在差异。3.分别用H37Rv、H37RvΔmazEF3、H37RvΔmazEF6和H37RvΔmazEF9菌株感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过CFU计数初步检测结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细菌的生存能力；利用流式细胞仪CELLQest和WinMDl2.9 Version软件检测巨噬细胞感染后的凋亡情况。
　　结果：经传代15代后，再次测序，未发生回复性突变，得到具有遗传稳定性的H37RvΔMazEF和H37RvΔRelBE基因缺失株。抗酸染色显示，H37RvΔmazEF菌株较野生菌株其形态短小；同时，CFU计数结果显示缺失菌株生长缓慢。细菌感染巨噬细胞后，缺失株在巨噬细胞内的生存能力低于野生菌株，且H37RvΔmazEF菌株感染组，巨噬细胞的凋亡率高于H37Rv菌株感染组。
　　结论：mazEF毒素-抗毒素系统有助于结核分枝杆菌在应激环境下的持留生存。研究结果表明了结核分枝杆菌感染机体后的持留性及其潜伏感染是多因素相互作用的结果，确切的感染机制有待于进一步研究。

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主要符号和缩略词语表

前言

材料

1.1菌种来源

1.2主要仪器设备

1.3主要实验试剂

1.4常用试剂的配制方法

方法

2.1结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统mazEF和relBE缺失株的构建及鉴定

2.2结核分枝杆菌H37RvΔMazEF缺失突变株生存能力的初步检测

2.3毒素-抗毒素系统MazEF基因与结核分枝杆菌持留性的相关研究

2.4统计学分析

结果

3.1 结核分枝杆菌H37RvΔMazEF和H37RvΔRelBE缺失突变株的筛选和鉴定

3.2 结核分枝杆菌H37RvΔMazEF缺失突变株生存能力的初步研究

3.3毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

讨论

4.1结核病流行及疫情现状

4.2结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统

4.3结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统MazEF

4.4 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统RelBE

4.5 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建

4.6 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株表型及其与生物学功能初步性分析

结论

参考文献

文献综述: 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的研究进展

致谢

作 者 简 介

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