HGF基因转染血管内皮祖细胞促进血管生成的动物实验研究

摘要

目的:
　　体外条件下从大鼠骨髓中分离出单个核细胞，使用特定的培养基使其向内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化生长，以Ad-GFP缺陷性腺病毒为载体将HGF基因转染原代培养的大鼠血管内皮祖细胞，之后注入缺血后肢裸鼠体内，观察其体内血管生成能力。
　　方法:
　　1.取4-6周龄Wistar大鼠(120-150g)双下肢股骨及胫骨骨髓，利用密度梯度离心法分离单个核细胞，并使用10％胎牛血清(FBS)DMEM诱导培养，使其分化为血管内皮祖细胞。
　　2.以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)为载体介导HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率。
　　3.建立裸鼠缺血后肢模型后，将裸鼠分为3组，分别为空白对照组、EPCs组、HGF病毒转染EPCs组(Ad-HGF-EPCs)，损伤后即刻及24h后分别将生理盐水、内皮祖细胞、携带HGF基因的EPCs以2×108cells细胞数由尾静脉注入裸鼠尾静脉。控制各鼠都输入同样生理盐水。观察期缺血肢体表现，ELISA检测血清HGF表达水平，激光多普勒(LDPI)检测血流灌注，CD31免疫组化检测毛细血管密度。
　　结果:
　　1.成功分离和培养出大鼠骨髓血管内皮祖细胞，EPCs摄取Dil-acLDL、结合FITC-UEA-1双荧光细胞阳性率为(88.0±5.0)％。
　　2.成功将HGF基因转染大鼠骨髓血管内皮祖细胞，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，转染72h后，转染效率高达80％以上。
　　3.实验中成功建立缺血后肢模型。术后2天，三组裸鼠缺血后肢功能评分迅速升至高峰，证实建模成功。HGF基因转染EPCs移植后，肢体自截率及坏死率明显降低，缺血后肢功能评分明显较EPCs组低，证实移植后有利于肢体存活和功能恢复。而且ELISA证实Ad-HGF-EPCs移植后体内HGF蛋白持续高表达，术后2天后即达峰值，此后逐渐降低，但仍高于未转染EPCs移植及空白对照，并至少持续21天。激光多普勒及CD31免疫组化检测发现HGF基因转染EPCs移植后，缺血后肢血流灌注量和血管密度显著增加，作用远强于EPCs单独移植。
　　结论:
　　腺病毒介导的HGF基因转染血管内皮祖细胞移植缺血后肢裸鼠后，可在体内持续过表达HGF蛋白，促进缺血后肢的血管生成，增加血管密度和血流量，改善后肢循环，有利于肢体存活和功能恢复。