PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂影响乳腺癌干细胞对内分泌治疗和靶向治疗耐药性的研究

摘要

目的:
　　研究抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K对乳腺癌干细胞(breast cancerstem cells，BCSCs)的作用及其对内分泌药物敏感性的影响;研究抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中mTOR表达对曲妥珠单抗耐药的BCSCs的作用及对靶向治疗药物敏感性的影响。
　　方法:
　　1.采用无血清培养液悬浮培养球囊细胞的方法富集乳腺癌细胞系MCF-7中的BCSCs，使用流式仪分选出ESA＋CD44＋CD24-/low亚群，并对其进行克隆培养。构建表达芳香化酶CYP19的真核表达载体（pHβ-Aro-CYP19），分别转染MCF-7中的BCSCs和非干细胞，从而获得高表达芳香化酶的BCSCs(BCSCs-CYP19)和非干细胞（MCF-7-CYP19）亚克隆。通过MTT检测细胞增殖、划痕实验评价细胞迁移能力、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡、软琼脂克隆实验评价细胞克隆形成能力，比较单用PI3K靶向抑制剂BKM120及其联合内分泌治疗药物来曲唑对BCSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的抑制作用的影响。利用Western blot检测单药BKM120或联合来曲唑用药对PI3 K/Akt/mTOR通路中AKT1、PI3K、S6的蛋白表达水平的影响。
　　2.通过使用不同浓度的曲妥珠单抗持续作用BT4746个月得到曲妥珠单抗耐药细胞BT474R，并通过MTT试验证实BT474R构建成功。采用无血清培养液悬浮培养球囊细胞的方法富集BT474和BT474R中的BCSCs，使用流式仪分选出ESA＋CD44＋CD24-/low的BCSCs亚群，并对其进行克隆培养。利用WesternBlot检测PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、AKT1、S6、mTOR蛋白表达水平的改变，评价该通路在曲妥珠单抗耐药过程中的作用影响。沉默BCSCs-BT474R中的mTOR，通过平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;利用Western Blot检测下调mTOR表达后的BT474R干细胞中PI3K、AKT1、S6、mTOR蛋白表达水平的改变，评价下调mTOR对BT474R-BCSCs的抑制作用。通过MTT检测细胞增殖、平板克隆实验评价细胞克隆形成能力，比较单用联合mTOR抑制剂依维莫司和靶向治疗药物曲妥珠单抗对BT474R-BCSCs的抑制作用的影响。
　　结果:
　　1.BKM120对BCSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的作用:与对照组相比，BKM120对MCF-7-CYP19及BCSCs-CYP19生长均具有抑制作用，抑制作用呈剂量依赖性。BKM120可降低BCSCs-CYP19的迁移能力、克隆形成能力和球囊形成能力。BKM120可显著降低BCSCs-CYP19中PI3K、AKT1、S6的蛋白表达水平。
　　2.BKM120联合来曲唑对MCF-7-CYP19及BCSCs-CYP19的作用:联合应用BKM120与来曲唑可抑制BCSCs-CYP19的克隆形成能力， G0-G1期细胞滞留比例增加，可诱导细胞早期凋亡，下调BCSCs-CYP19中PI3K、AKT1、S6的蛋白表达。
　　3.PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠单抗耐药细胞中处于激活状态;沉默BT474R-BCSCs的mTOR，BT474R-BCSCs对曲妥珠单抗的抵抗作用降低，位于mTOR上游的蛋白的表达无显著变化，而mTOR表达及其下游的S6蛋白磷酸化显著降低。证实PI3K/Akt通路下游分子mTOR在曲妥珠单抗耐药中发挥重要作用。
　　4.mTOR抑制剂依维莫司可有效抑制BT474R-BCSCs的生长和体外克隆形成能力，其联合曲妥珠单抗抑制BT474R-BCSCs生长的作用更强。
　　结论:
　　1.PI3K抑制剂BKM120可抑制内分泌治疗耐药的BCSCs，BKM120联合来曲唑较单药可更有效的抑制内分泌治疗耐药的BCSCs并下调PI3K/Akt/mTOR通路中重要下游产物的表达，在逆转内分泌治疗耐药的乳腺癌治疗中有潜在的应用价值。
　　2.PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠单抗耐药细胞中处于激活状态，沉默mTOR和应用mTOR抑制剂依维莫司可有效抑制曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞和BCSCs，在逆转曲妥珠单抗耐药的乳腺癌治疗中有潜在的应用价值。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、PI3K抑制剂BKM120联合来曲唑对BCSCs-CYP19的作用

1．1 对象和方法

1．1．1 对象

1．1．2 常用试剂

1．1．3 主要实验仪器

1．1．4 实验方法

1．1．5 统计学方法

1．2 结果

1．2．1 真核表达载体的鉴定及稳定克隆的筛选并验证

1．2．2 BKM120、来曲唑单药及联合时对BCSCs-CYP19的生长抑制作用

1．2．3 BKM120、来曲唑单药及联合时对BCSCs-CYP19细胞周期的影响

1．2．4 BKM120、来曲唑单药及联合时对BCSCs-CYP19凋亡的作用

1．2．5 BKM120、来曲唑单药及联合时对BCSCs-CYP19克隆形成能力的影响

1．2．6 BKM120联合来曲唑对乳腺癌干细胞迁移能力的影响

1．2．7 BKM120联合来曲唑对PI3K／Akt／mTOR通路活性的影响

1．3 讨论

1．4 小结

二、mTOR靶向调控HER2阳性乳腺癌干细胞曲妥珠单抗耐药的研究

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 常用试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 实验方法

2．1．5 统计学方法

2．2 结果

1．2．1 BT474R对曲妥珠单抗的耐药性

1．2．2 BT474R及BT474细胞中干细胞比例检测

2．2．3 BT474R中PI3K／Akt／mTOR相关通路改变情况

2．2．4 下调mTOR对BT474R-BCSCs克隆形成能力的影响

2．2．5 下调mTOR后BT474-BCSCs中PI3K／Akt／mTOR通路的改变

2．2．6 mTOR抑制剂依维莫司联合曲妥珠单抗对BT474R-BCSCs的生长抑制作用

2．3 讨论

2．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 mTOR抑制剂在乳腺癌内分泌治疗耐药的研究进展

致谢