人类早期胚胎植入前高通量测序遗传学筛查的研究

摘要

目的：本研究利用单细胞全基因组扩增（WGA）和高通量测序技术对人类早期胚胎植入前的遗传学信息进行筛查，从而为高通量测序技术在提高PGS/PGD技术的安全有效性方面奠定方法学基础。
　　方法：选取于我院生殖中心行 IVF/ICSI-ET并已生育健康婴儿的患者，他们将冻存的剩余第三天优质胚胎41枚和囊胚9枚自愿捐献用于科研并签署知情同意书。D3胚胎和囊胚分别活检单个卵裂球细胞和滋养外胚层5~10个细胞进行全基因组扩增（单细胞裂解、文库制备、扩增、检测扩增产物的浓度和完整性）。活检后D3胚胎进一步培养观察，若有囊胚形成则再行囊胚活检和全基因组扩增。全基因组扩增后进行高通量测序，将待测片段与微球体连接和 cDNA序列测定从而对植入前胚胎进行染色体数目和16Mb以上缺失、重复的筛查。
　　结果：1、活检胚胎来源：41枚D3胚胎和9枚囊胚经解冻复苏后均存活。D3胚胎活检后发育成囊胚的共5枚，共对55枚（D3胚胎41枚和囊胚14枚）胚胎进行活检和全基因组扩增。
　　2、全基因组扩增结果：42枚胚胎扩增成功（D3胚胎28枚和囊胚14枚），总扩增成功率为76.4％（42/55）。D3胚胎中28枚扩增成功，13枚扩增失败， D3胚胎单细胞的扩增成功率68.3%(28/41)。14枚囊胚全部扩增成功。对这42枚胚胎的全基因组扩增产物进行高通量测序分析。
　　3、D3胚胎的高通量测序分析结果：28枚D3胚胎中11枚未检测出染色体数目异常和16Mb以上缺失和重复；2枚胚胎检出染色体数目异常，5枚胚胎检出片段＞16Mb的染色体缺失或重复，10枚胚胎检出染色体数目异常合并片段＞16Mb的缺失或重复。
　　4、囊胚的高通量测序分析结果：14枚囊胚中8枚未检测出染色体数目异常和16Mb以上缺失和重复，5枚胚胎检出染色体数目异常，1枚胚胎检出片段＞16Mb的染色体缺失或重复。
　　5、高通量测序技术染色体数目异常和＞16Mb的缺失、重复检出率：本研究中总体染色体数目异常或者＞16Mb染色体片段的缺失、重复的检出率为54.8%（23/42），D3胚胎和囊胚的检出率分别为60.7%（17/28）和42.9%（6/14）。
　　6、同一胚胎的D3和囊胚期的高通量测序分析结果：5枚胚胎分别在 D3和D5（囊胚）做了单细胞活检和滋养层细胞活检、全基因组扩增和高通量测序，结果显示同一胚胎的D3单细胞和囊胚滋养外胚层的染色体检出信息是基本一致的。
　　7、对捐献胚胎的患者夫妇（共8对）的临床资料进行回顾性分析发现：这些夫妇均单独存在或合并存在女方高龄（大于等于35岁）、严重男方因素，反复植入失败和不良妊娠史，所有检测的胚胎均来自存在这些高危因素的夫妇。涉及女方高龄、严重男方因素，反复植入失败和不良妊娠史因素的胚胎染色体数目异常或＞16Mb的缺失或重复异常检出率分别为80%，33.33%，33.33%和28.57%。
　　结论：1、人类D3胚胎（7~9细胞）可以通过单卵裂球活检、单细胞全基因组扩增和高通量测序进行PGS/PGD，解决了囊胚形成率低无可活检的胚胎用于PGS/PGD这一问题，扩展了高通量测序的适用范围，更有利于高通量测序技术的临床推广和应用。
　　2、在体外受精—胚胎移植技术中，即使是优质胚胎，仍然存在一定比例的染色体数目异常或染色体的缺失重复，这可能是辅助生育技术中种植失败或流产的重要原因。
　　3、女方高龄、严重男方因素、反复植入失败和具有不良妊娠史患者的胚胎具有较高的遗传学异常的风险，PGS技术可能有助于提高上述患者助孕治疗的成功率和抱婴率。
　　4、分子生物学的飞速发展为PGS/PGD提供了更多的手段，胚胎的基因学信息会更精细和广泛，但是基因的片段与功能、表型、疾病之间的关系研究将是一个长期巨大的工作和课题。因此，PGS/PGD技术必须基于和患者的充分告知和知情同意，必须结合产前诊断和出生随访，才能保证这一技术安全有效的进行，提高助孕治疗的成功率和活产率。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1.研究对象

1.1研究对象

1.2实验设备

1.3.实验耗材

1.4.实验试剂

2.研究方法

2.1单个卵裂球细胞的活检

2.2囊胚期滋养外胚层细胞的活检

2.3样品包装和运输

2.4 单细胞全基因组扩增（sigma试剂盒, DOP-PCR技术原理）

2.5.高通量测序（high-throughput sequencing）

3.结果

3.1一般资料

3.2检测结果

3.3.电泳胶图

3.4.核型分析图

3.5.胚胎的临床资料回顾性分析

4.讨论

4.1染色体异常的发生机制和影响因素

4.2 胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation genetic screening）

4.3全基因组扩增（whole genome amplification,WGA）

4.4高通量测序技术（High-throughput sequencing）

4.5.拷贝数变异（Copy-number variant，CNV）

4.6各种检测技术的比较

4.7 存在的问题

4.8.高通量测序技术应用于D3胚胎单细胞PGS

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:胚胎植入前遗传学诊断和筛查的研究进展

致谢