肺炎衣原体感染通过促进VE-钙粘素磷酸化增加内皮细胞通透性而诱导单核细胞跨内皮迁移

摘要

目的：
　　利用肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，C.pn）体外感染人脐静脉内皮细胞系Ea. hy926细胞模型，观察C.pn感染对单核细胞跨内皮迁移的影响，并从血管内皮细胞（Vascular endothelial cell，VEC）通透性角度探讨C.pn感染促进单核细胞跨内皮迁移的机制，证实C.pn感染可通过促进血管内皮细胞钙粘素（Vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）的酪氨酸磷酸化增加VEC的通透性，进而诱导单核细胞跨内皮迁移。
　　方法：
　　1.免疫荧光法鉴定人脐静脉内皮细胞系Ea.hy926；
　　2.利用 Perco ll非连续性密度梯度离心法分离人血液中的单核细胞；跨内皮迁移实验观察C.pn感染对单核细胞跨内皮迁移的影响；
　　3.跨内皮电阻（Transendothelial electrical resistance，TEER）实验检测C.pn感染对VEC通透性的影响；
　　4.免疫荧光法观察C.pn感染对VE-cadherin分布的影响；
　　5.采用Western blot技术检测C.pn感染后VEC内VE-cadherin总蛋白及磷酸化蛋白表达水平的变化；
　　6.利用免疫共沉淀技术提取Src结合蛋白，液闪计数仪检测C.pn感染后Src激酶活性的改变；
　　7.用Src激酶选择性抑制剂PP2预处理VEC后，Western blot检测C.pn感染后VE-cadherin酪氨酸磷酸化水平的变化；
　　8.用PP2预处理VEC后，免疫荧光法观察C.pn感染对VE-cadherin分布的影响；
　　9.用PP2预处理VEC后，利用TEER实验检测C.pn感染对VEC通透性的影响；
　　10. PP2预处理VEC后，跨内皮迁移实验观察C.pn感染对单核细胞跨内皮迁移的影响。
　　结果：
　　1.Ⅷ因子免疫荧光染色鉴定Ea. hy926细胞系，结果显示，培养的Ea. hy926细胞的胞浆呈绿色荧光，确定为VEC；
　　2.单核细胞跨内皮迁移实验结果显示，C.pn感染VEC24 h后，单核细胞跨内皮迁移的数目明显多于正常对照组（P<0.05）；
　　3. TEER实验结果显示，C.pn感染VEC后，TEER值呈时间依赖性下降；感染后12 h至24 h下降速度加快，感染后24 h的TEER值明显低于正常对照组，其差异有统计学意义（P<0.05）；
　　4.共聚焦显微镜观察，正常对照组的VE-cadherin均匀分布于细胞与细胞连接处，为连续不间断的状态；C.pn感染VEC24 h后，VE-cadherin在胞膜上的表达下降，而在胞浆分布增多，呈弥散分布，细胞与细胞连接处出现明显缝隙；
　　5. Western blot实验结果显示，C.pn感染VEC后各个时间点的VE-cadherin总蛋白表达水平与0 h比较无明显变化；而在感染24 h和48 h时，VE-cadherin（Y658）酪氨酸磷酸化水平均明显高于正常对照组（P<0.05），但感染后24 h和48 h之间的酪氨酸磷酸化水平无统计学差异；
　　6.液闪计数仪检测结果显示，C.pn感染VEC12 h时Src激酶活性开始升高，至感染后24 h达到峰值；随后开始下降，并持续至感染后48 h。感染后各时间点的Src激酶活性均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；
　　7. Western blot实验结果显示，C.pn感染VEC24 h时，VE-cadherin（Y658）的酪氨酸磷酸化水平明显高于正常对照组，而 C.pn感染+ PP2组的VE-cadherin（Y658）酪氨酸磷酸化水平与单纯C.pn感染组相比却明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；
　　8.共聚焦显微镜观察到，PP2预处理 VEC后可抑制 C.pn感染引起的VE-cadherin由胞膜向胞浆的分布，并使细胞间连接处的缝隙减小。
　　9. TEER实验结果显示，C.pn感染可降低VEC的TEER值，且呈时间依赖性。PP2预处理后，VEC的TEER值下降趋缓（P<0.05）；
　　10.单核细胞跨内皮迁移实验结果显示：C.pn感染VEC24 h时，单核细胞跨内皮迁移的数目明显高于正常对照组（P<0.05），而C.pn感染+PP2组的单核细胞跨内皮迁移数则显著低于单纯C.pn感染组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　C.pn感染可能通过激活Src激酶促使VE-cadherin（Y658）发生酪氨酸磷酸化以增加VEC的通透性，进而促使单核细胞跨内皮迁移。

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声明

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、C.pn感染通过增加VEC通透性促进单核细胞跨内皮迁移

实验一C.pn感染促进单核细胞跨内皮迁移

实验二C.pn感染对VEC通透性的影响

二、C.pn感染对VE-cadheri n的分布和酪氨酸磷酸化的影响

实验一C.pn感染对VE-cadheri n分布的影响

实验二C.pn感染促进VEC VE-cadherin磷酸化

实验三C.pn感染通过Src激酶促进VE-cadherin酪氨酸磷酸化

三、C.pn感染通过促进VE-cadherin酪氨酸磷酸化增加VEC通透性而诱导单核细胞跨内皮迁移

实验一VE-cadherin酪氨酸磷酸化对VE-cadherin分布的影响

实验二VE-cadheri n酪氨酸磷酸化在C.pn感染增加VEC通透性中的作用

实验三VE-cadherin酪氨酸磷酸化在C.pn感染促进单核细胞跨内皮迁移中的作用

讨论

小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: VE-cadherin在内皮细胞通透性中的调控作用及其研究进展

致谢