在不同生理阶段的小鼠心脏中进行的全基因表达谱芯片分析与功能学网络预测

摘要

目的： 传统观念认为，哺乳动物的心肌细胞会永久失去增殖能力。最近，有研究证实，切除出生24小时内小鼠的部分心室肌组织可刺激损伤区域周围的心肌细胞活化，进而修复损伤区域；并且在青春期早期甲状腺激素的激增可能在心肌细胞增殖调控中发挥重要作用。上述研究结果表明哺乳动物的心肌细胞可能存在增殖现象，并且可以通过生理或病理刺激驱动。对出生后不同生长发育阶段的小鼠心肌组织进行分子生物学分析，可以深化对心肌细胞增殖或细胞周期停滞相关信号调控的理解。本课题的主要研究目是在前期研究成果的基础上，针对不同生长发育阶段小鼠的心肌组织进行全基因表达谱芯片分析，在基因转录水平探讨导致小鼠心肌细胞增殖或细胞周期停滞现象的分子机理，以期发现未知的信号传递靶点。 方法： 本课题组根据大量文献报道与前期研究成果，最终选定三个时间点进行实验，即出生后24小时（包含增殖性心肌细胞），出生后7天（包含爆发增殖心肌细胞）和出生后10周（包含细胞周期停滞的心肌细胞），在提取心肌组织mRNA后，使用Affymetrix Mouse Gene1.0ST微阵列芯片进行全基因表达谱芯片检测与分析。为了准确筛选差异表达基因，本课题组利用随机方差模型（random variance model）修正的F检验计算基因表达差异的显著性水平（p值）和误判率（false discovery rate）并根据上述计算结果制定差异表达基因筛选标准。本课题组利用基因本体学数据库进行差异表达基因的显著靶向性功能分析，并使用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平（p值）和误判率，从而筛选出差异表达基因所具有的全部显著性功能。本课题组利用KEGG、Biocarta等数据库进行差异表达基因参与的信号转导通路分析，利用Fisher精确检验和卡方检验进行显著性水平（p值）计算。本课题组利用簇系实验（Series Test of Cluster）原理进行逻辑序列实验中基因表达趋势分析，实现对基因表达趋势的聚类分析，从而更精确、直观地筛选出随样本逻辑趋势变化而产生的最显著、最主流基因群，并在上述表达趋势聚类中的基因进行共表达基因的功能显著性分析。本课题组利用动态基因网络分析绘制出差异表达基因之间联系与相互作用的动态学网络图谱。最后，基于KEGG数据库，选定细胞周期、细胞分裂和细胞分化三个方向进行了差异表达基因间相互作用网络的构建。 结果： 本课题分析了小鼠出生后24小时（包含增殖性心肌细胞），出生后7天（包含爆发增殖心肌细胞）和出生后10周（包含细胞周期停滞的心肌细胞）的心肌组织全基因表达谱芯片。从多个角度针对心肌细胞增殖和细胞周期停滞的现象进行了基因转录水平分析。本课题组发现在差异表达基因的显著靶向性功能分析中，随着年龄增长，显著性功能的变化主要与“细胞周期”、“细胞分裂”、“有丝分裂”和“代谢过程”等功能相关。在差异表达基因参与的信号转导通路分析中“细胞周期”、“PI3K-AKT信号通路”和“代谢途径”等信号转导通路富集程度较高。值得注意的是，逻辑序列实验中基因表达趋势分析提示BMP1、BMP10、CCNE2、E2F1和IGF1等基因在出生后7天（青春期早期）的心肌组织中存在的爆发性表达现象。动态基因网络分析显示CCNB1、BUB1、TNNI1、NDC80、DYNLT1α、CCNB2和CDK2等基因表达下调，TMOD4、PFKFB2、NAMPT和GRM1等基因表达上调，这部分基因可能是驱动心肌细胞逐渐转向低增殖能力的关键驱动因素。更重要的是，通过对细胞周期、细胞分裂和细胞分化三个方向基因间相互作用网络的构建，本课题组预测在出生后心肌细胞周期、分化停滞的现象中，发挥重要作用的基因包括ANAPC1、CDC20、CDK1、MYC、CDC25C、GADD45α和BMPs等。 结论： 本课题已检测出涉及小鼠心肌细胞增殖，爆发性增殖和细胞周期停滞阶段的基因转录水平变化，筛选出上述生长发育过程中调控能力较强的基因群，识别并分析了可能参与诱导心肌细胞增殖的潜在信号因子。本课题可为小鼠心肌细胞增殖和发育的相关研究提供重要基础与参考。

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