阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者二次基因突变促进克隆增殖的机制研究

摘要

目的： 分析阵发性睡眠性血红蛋白尿症（Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）患者的临床数据，评估糖皮质激素及化疗的治疗疗效及预后影响因素；通过全外显子测序技术分析PIG-A基因突变及PIG-A基因突变之外的其他基因突变，筛选可能致病突变并研究其在PNH克隆增殖中的作用，初步探讨PNH克隆获得增殖优势的可能机制。 方法： 1.回顾性分析天津医科大学总医院血液科92例PNH患者的临床资料，总结PNH患者的临床特征及常见并发症，观察糖皮质激素治疗及化疗的疗效，分析影响生存和预后的危险因素，包括LDH水平、PNH克隆大小、是否合并血栓、是否合并骨髓衰竭、溶血发作频率与预后之间的关联。 2.选取PNH患者13例，免疫磁珠分选外周血粒细胞的CD59-细胞，提取CD59-细胞基因组DNA进行全基因组外显子测序，对测序原始数据进行生物信息处理、分析并筛选致病突变基因。分析PIG-A基因突变位点、突变形式及突变率；对上述筛选出的PIG-A基因之外的其他突变基因及血栓相关基因进行基因聚类及突变聚类分析，同时进行KEGG信号通路富集分析。 3.体外培养K562细胞，采用流式细胞术检测K562细胞及PNH患者CD59-细胞的比例，qPCR方法分别检测上述细胞中所筛选出的致病突变基因mRNA的表达水平，筛选出表达丰度一致且显著高表达的基因RBPJ进行深入研究。采用siRNA技术沉默RBPJ基因的表达，应用CCK-8检测沉默前后细胞增殖水平，应用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。 结果： 1.92例PNH患者的临床资料总结：PNH的临床表现主要包括血红蛋白尿（61.73%）、贫血（88.89%）、出血（14.81%）和全血细胞减少（20.99%）。并发症主要包括感染（35.87%）、血栓栓塞（13.58%）和肾功能损害（16.05%）。糖皮质激素治疗PNH的1年总有效率为70.37%，经过2-4周的治疗后，血红蛋白水平显著增加，而RET、LDH、TBIL水平均减少，显示良好的治疗反应。对复发难治或对激素依赖、无法减量而出现严重并发症的PNH患者采用减低剂量的DA或HA方案化疗后，溶血指标明显好转，PNH克隆显著降低；所有患者均脱离输血，且肾上腺糖皮质激素的用量较化疗前减少一半以上。PNH确诊后10年的总生存期为70.09%，LDH显著升高、合并血栓并发症及合并骨髓衰竭性疾病均是10年生存率降低的不良因素。 2.PNH克隆细胞基因突变检测：（1）对7例PNH患者和6例PNH-AA患者进行全外显子组测序，测序平均深度为500×，约95%的外显子区域覆盖度可达100×以上。原始数据结果包括191059个单核苷酸变异和24404个插入/缺失突变，其中包括29364个非同义突变、7936个截断突变、893个移码突变、465个剪切位点突变。原始数据经质量过滤、分析筛选后，共筛选出基因编码区和剪切位点1652个，其中包括1074个非同义突变和578剪切位点突变，这些可能导致蛋白功能变化的有意义变异包括：378个无义突变、139个剪切位点突变、151个移码突变和821个位于高度保守序列区的非同义突变。13例患者共检测到1-3级别的突变基因有10009种，其中1、2级突变基因4027种，3级突变基因5982种。 （2）61.54%PNH患者(8/13)检测到了PIG-A基因突变，突变形式主要包括移码、截断、剪切位点及非同义突变。其中剪切位点、移码和截断的突变级别均为1级，非同义突变级别为2级。 （3）除PIG-A基因外，对上述1-3级别的突变基因进行了体细胞基因聚类分析，即在同一个基因上有突变（不限于同一个位点）的所有样本。其中共有样本数大于等于5例的突变基因共43个，突变形式包括非移码、非同义、移码和非编码区突变。 （4）对经生物信息过滤、筛选出的5717个1-3级别的突变基因进行了KEGG信号通路富集分析，被富集的信号通路包括：Apoptosis信号通路、花生四烯酸代谢信号通路、抗原加工和表达信号通路、AMPK信号通路和adherens junction信号通路，差异无统计学意义（p＞0.05）。参考COSMIC肿瘤体细胞突变相关基因库分析测序数据发现共存在112个肿瘤相关基因，KEGG通路富集分析结果示Pathways in cancer通路差异具有显著性（p=0.00），提示肿瘤通路基因的体细胞突变在PNH患者中反复出现。 （5）对原始测序数据经过过滤筛选后，总突变数为105994个，血栓相关基因为529个。各数据库（dbSNP，千人中国，ExAC）频率＜5%的总突变数为73个，1-3级突变基因总数为20个。其中1-2级突变基因包括BMPR2、ZFPM2、F5、F8、F12、F13A1、MCL1、MMRN1、NBEAL2、NOS1和PC；3级突变基因包括ETV7、F2R、GP1BB、ITGA2B、NOS2、PF4、SERPINC1、THBD和THBS1。KEGG通路富集分析结果显示血栓相关突变基因在Notch信号通路，Wnt信号通路和花生四烯酸代谢信号通路上显著富集，且上述信号通路在统计学上有显著性差异（p＜0.05）。 3.致病突变基因RBPJ表达沉默及细胞功能检测：（1）进一步筛选出高表达的目的基因18个：RYR1、MUC2、FLG、WASH1、ZNF717、UBXN11、TCHH、CTBP2、ANAHK2、ANAHK、MUC12、LILRB3、POTEH、HRNR、MECOM、RBPJ、DNAH14和NBPF1，22例PNH患者和K562细胞qPCR结果示RBPJ基因均为高表达，K562细胞转染siRNA靶向基因RBPJ后，RBPJ基因被沉默,其mRNA表达水平下降50%以上。 （2）细胞增殖实验结果显示siRNA-RBPJ转染后24h细胞增殖活力无明显改变，随着转染时间的延长，细胞增殖活力呈逐渐降低趋势，siRNA-RBPJ转染后72h，对照组、siRNA-scr转染组和siRNA-RBPJ转染组细胞的OD值分别为：1.9690±0.2062、1.2660±0.3878和0.4947±0.0992，组间比较结果为：siRNA-RBPJ转染组与siRNA-scr组、siRNA-RBPJ转染组与空白对照组均有显著性差异（p值分别为0.0289和0.0004），空白对照组与siRNA-scr组间无明显差异（p=0.0502），三组间比较有显著差异（p=0.0014）。 （3）细胞凋亡实验结果显示：细胞凋亡实验结果显示siRNA-RBPJ转染后细胞凋亡率增加，且随着转染时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐升高趋势。siRNA-RBPJ转染后72h，对照组、siRNA-scr转染组和siRNA-RBPJ转染组细胞的凋亡率分别为：（4.271±0.3881）%、（5.000±0.5237）%和（25.71±3.9490）%。组间比较结果为：siRNA-RBPJ组与siRNA-scr组、siRNA-RBPJ转染组与对照组均有显著性差异（p值分别为0.0008和0.0007），对照组与siRNA-scr组间无明显差异（p=0.1059），三组间比较有显著差异（p＜0.0001）。 （4）细胞周期实验结果显示：siRNA RBPJ转染后，siRNA-RBPJ组细胞G0/G1期与对照组、siRNA-scr比较均有显著性差异，p值分别为0.0285和0.0150，对照组与siRNA-scr比较无显著性差异（p=0.0.9550），三组间比较有显著性差异（p=0.0198）；siRNA-RBPJ组细胞S期与对照组、siRNA-scr比较均有显著性差异（p值分别为0.0028和0.0112），对照组与siRNA-scr比较无显著性差异（p=0.7652），三组间比较有显著性差异（p=0.0006）。沉默RBPJ基因表达后，处于G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减低，细胞阻滞于G0/G1期，细胞增殖能力减弱。 结论： 1、PNH的临床表现主要包括血红蛋白尿、贫血、出血和全血细胞减少，感染、血栓栓塞和肾功能损为PNH较常见并发症；糖皮质激素是治疗PNH控制溶血发作的首选一线药物，疗效确切，其总有效率为70.37%%。减低剂量的DA或HA方案化疗对复发难治或对激素依赖、无法减量而出现严重并发症的PNH患者可取得较满意疗效。PNH确诊后10年的总生存期为70.09%，LDH显著升高、合并血栓并发症及合并骨髓衰竭性疾病均是10年生存率降低的不良因素。 2、应用全基因组外显子测序技术发现了除PIGA之外的其他突变基因，包括ZNF717、SUZ12、RBPJ、MUC4、CUX1、MLL2、MAGEC1和TET2等，上述基因的功能均与调控细胞增殖、分化，抗凋亡，促进肿瘤细胞侵袭、进展密切相关，再次证实二次基因突变参与了PNH克隆的增殖。 3、通过全外显子测序技术检测到F5、F8、F12、ZFPM2、THBD和ITGA2B等血栓相关基因突变，且富集信号通路包括Notch、Wnt和花生四烯酸代谢信号通路。基因突变可能是PNH患者血栓形成的遗传风险因素之一。 4、PNH患者二代测序筛选出高表达的一级突变基因RBPJ基因，验证其在K562细胞中高表达后，siRNA-技术沉默RBPJ基因后发现处于G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减低，细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡率增加，增殖能力减弱。提示RBPJ基因高表达可能参与了PNH异常克隆的增殖。

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3.2.8 siRNA RBPJ转染前后K562细胞的细胞周期分布结果比较…………76

3.1对象和方法

3.1.1研究对象

3.2.1 K562细胞中18种突变基因mRNA的表达检测

qPCR结果显示在K562细胞中，RBPJ、ZNF717、MECOM 、CTBP2、ANAHK、UBXN11 mRNA的表达丰度为高，RYR1、FLG、POTEH、HRNR、 TCHH、 AHNAK、NBPF1、MUC12 mRNA的表达丰度为中，MUC2、WASH1、LILRB3、DNAH14 mRNA的表达丰度为低（表3.2，图3.1、3.2）。

图3.1 K562细胞中18种突变基因mRNA的表达量比较

图3.2 K562细胞中18种突变基因mRNA的表达

3.2.2 PNH患者CD59-细胞内PNH克隆检测及分选流式图

我们选取的22例PNH患者外周血粒细胞CD59-细胞比例为（78.63±21.94）%（图3.3-A、3.3-B），利用流式细胞术分选外周血粒细胞CD59-细胞，分选纯度为96.63%，分选后CD59-细胞数量为5×109（图3.3-C、3.3-D）。

图3.3流式分选示意图

3.2.3 PNH患者CD59-细胞中18种突变基因mRNA的表达检测

qPCR结果显示在22例PNH患者的CD59-细胞中，RBPJ、ZNF717、RYR1、 UBXN11mRNA的表达丰度为高度，FLG、WASH1、POTEH、HRNR、TCHH、 ANAHK2、ANAHK、MECOM、CTBP2、MUC12 mRNA的表达丰度为中度，MUC2、NBPF1、LILRB3、DNAH14 mRNA的表达丰度为低度（表3.3，图3.4）。

图3.4 PNH患者CD59-细胞中18种突变基因mRNA的表达量比较

3.2.4 筛选目的基因进行深入研究

通过对18种突变基因在K562细胞和PNH患者CD59-细胞mRNA表达量的结果分析，我们筛选出表达丰度一致且显著高表达的突变基因RBPJ，并对RBPJ mRNA 表达水平与PNH克隆的相关性进行了分析，结果示二者呈显著正相关（r=0.7170, p=0.0003，图3.5）。

图3.5 RBPJ mRNA表达水平与PNH克隆相关性分析

3.2.5 qPCR测定K562细胞中RBPJ 、siRNA RBPJ mRNA的表达结果及转染效率检测

3.2.6 siRNA RBPJ转染前后24h，48h，72h K562细胞增殖活性比较