蛋白质吸附平衡和动力学理论研究

摘要

蛋白质的离子交换平衡和动力学行为在生物分离过程的设计和优化中起着十分重要的作用.然而,离子交换色谱理论尚不完善,围绕蛋白质离子交换色谱理论,本文展开了以下的研究工作: 1.采用统计热力学模型(ST模型)研究了蛋白质(BSA和Hb)在阴离子交换剂DEAE Spherodex M上的吸附平衡行为.结果表明,ST模型可以很好地描述不同离子强度条件下单组分和双组分蛋白质的吸附平衡行为.随着离子强度增高,吸附相伴离子对蛋白质与吸附剂之间和蛋白质分子间静电力的屏蔽作用增大.在相同的离子强度条件下,BSA与DEAE Spherodex M之间的静电引力较强；BSA分子之间的静电斥力大于Hb分子之间的静电斥力.在相同的离子强度条件下的Hb-BSA双组分吸附体系中,BSA与吸附界面静电吸引作用强,吸附竞争力强.由ST模型参数1/α<,i>和k<,ii>分别计算得到蛋白质的有效电荷数基本一致. 2.采用ST模型进而研究了BSA和lib在阳离子交换剂SP Sepharose FF的吸附平衡行为.研究结果表明,随着离子强度增高,吸附相伴离子对蛋白质与吸附剂之间和蛋白质分子间静电力的屏蔽作用增大；而溶液pH值的升高引起蛋白质与吸附界面间的静电引力及蛋白质分子间静电斥力减弱.在相同的离子强度和pH值条件下,Hb与SP Sepharose FF之间的静电引力较强；Hb分子之间的静电斥力大于BSA分子之间的静电斥力.此时,在Hb-BSA双组分吸附体系中,Hb与吸附界面静电吸引作用强,吸附竞争力强. 3.建立了考虑吸附剂的粒径分布(PSD)的有效孔扩散模型(EPDM)、表面扩散模型(SDM)、Maxwell-Stefan模型(MSM).通过蛋白质的间歇吸附动力学实验,研究了蛋白质(BSA)在阳离子交换剂(SP Sepharose FF)孔内的扩散.结果表明,这三种模型均能很好地拟合蛋白质的动态吸附曲线；但由于传质驱动力不同,各模型对孔内蛋白质沿吸附剂径向浓度分布图的预测存在较大差异. 4.利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)直接观测了蛋白质在吸附剂颗粒内部的径向浓度分布情况.通过观测结果与考虑吸附剂PSD的模型(EPDM,SDM和MSM)拟合吸附剂孔内蛋白质径向浓度分布结果的比较,可以看出在目前的研究体系中SDM能够比EPDM更好地预测孔内蛋白质浓度分布图,MSM模型对孔内蛋白质浓度分布的预测结果介于另外两种模型之间. 5.由于在使用共聚焦显微镜观测吸附剂孔内蛋白质时,需要用荧光色素标记蛋白分子,给实验结果带来了误差.考虑到使用绿色荧光蛋白作为模型蛋白可以避免荧光修饰蛋白质带来的不均匀性,因此本研究使用硫酸铵沉淀、体积排阻色谱、阴离子交换色谱对含有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的质粒pUC18的基因工程重组大肠杆菌进行纯化,分离后得到的目标蛋白为电泳纯,eGFP的荧光特性不受分离过程的影响.为了更大规模的分离纯化eGFP,进行了膨胀床吸附技术分离eGFP的初步研究.

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1前言

1.2生物分离工程中的液相色谱技术

1.2.1离子交换色谱

1.2.2体积排阻色谱

1.2.3反相色谱

1.2.4疏水作用色谱

1.2.5亲和色谱

1.2.6灌注色谱

1.3膨胀床吸附技术

1.3.1膨胀床吸附原理

1.3.2膨胀介质

1.3.3膨胀床的装置

1.3.4膨胀床操作特点

1.3.5膨胀床吸附技术的应用

1.4蛋白质离子交换吸附平衡

1.4.1 Langmuir模型

1.4.2指数修正的Langmuir模型

1.4.3化学计量顶替模型

1.4.4空间质量作用模型

1.4.5有效面积模型

1.4.6统计热力学模型

1.5蛋白质在色谱介质中扩散动力学

1.5.1孔扩散模型

1.5.2表面扩散模型

1.5.3均质固相扩散模型

1.5.4平行扩散模型

1.5.5 Maxwell-Stefan模型

1.6荧光分析技术

1.6.1荧光分析法

1.6.2共聚焦激光扫描显微镜技术

1.7本文的主要工作

第二章蛋白质阴离子交换吸附平衡的统计热力学模型分析

2.1前言

2.2模型方程

2.2.1模型假设

2.2.2等温方程

2.3实验材料与方法

2.3.1实验材料与设备

2.3.2缓冲液的配制

2.3.3蛋白质标准曲线的绘制

2.3.4 BSA和Hb吸附平衡实验

2.4结果与讨论

2.4.1蛋白质和吸附剂的理化性质

2.4.2不同离子强度条件下单组分蛋白质吸附等温线

2.4.3离子强度对α的影响

2.4.4离子强度对kii的影响

2.4.5组分蛋白质吸附平衡

2.5小结

主要符号说明

第三章蛋白质阳离子交换吸附平衡的统计热力学模型分析

3.1前言

3.2模型方程

3.2.1模型假设

3.2.2等温方程

3.3实验材料与方法

3.3.1实验材料与设备

3.3.2缓冲液的配制

3.3.3蛋白质标准曲线的绘制

3.3.4吸附剂性质的测定

3.3.5 BSA和Hb吸附平衡实验

3.3.6确定吸附相体积

3.4结果与讨论

3.4.1不同液相条件下单组分蛋白质吸附等温线

3.4.2液相条件对α的影响

3.4.3液相条件对kii的影响

3.4.4不同蛋白浓度比例时双组分蛋白质的吸附平衡

3.4.5液相条件对双组分蛋白质吸附平衡的影响

3.4.6液相条件对双组分ST模型参数kij的影响

3.5小结

主要符号说明

第四章蛋白质离子交换吸附动力学

4.1前言

4.2吸附动力学模型

4.2.1有效孔扩散模型

4.2.2表面扩散模型

4.2.3 Maxwell-Stefan模型

4.2.4主体液相蛋白质的浓度变化方程

4.2.5数值解法

4.3实验材料与方法

4.3.1实验材料与仪器

4.3.2离子交换平衡和吸附动力学实验

4.3.3离子交换剂有效孔隙率的测定

4.3.4分析方法

4.4结果与讨论

4.4.1蛋白质吸附等温线

4.4.2 SP Sepharose FF的粒径分布

4.4.3吸附动力学：模拟蛋白质的动态吸附曲线

4.4.4吸附剂颗粒内部蛋白质浓度分布

4.5小结

主要符号说明

第五章利用CLSM分析固相蛋白质浓度分布和扩散模型

5.1前言

5.2理论模型

5.3实验材料与方法

5.3.1实验材料与仪器

5.3.2实验方法

5.4结果与讨论

5.4.1吸附剂颗粒内部蛋白质浓度分布结果(CLSM结果)

5.4.2激光穿透深度对实验结果的影响

5.4.3比较不同模型对吸附剂孔内蛋白质浓度分布的模拟

5.5小结

主要符号说明

第六章增强型绿色荧光蛋白的分离纯化

6.1前言

6.2实验材料与方法

6.2.1实验试剂

6.2.2实验设备

6.2.3溶液的配制

6.2.4 eGFP粗品的制备

6.2.5盐析法初级纯化eGFP

6.2.6体积排阻色谱纯化eGFP

6.2.7阴离子交换色谱纯化eGFP

6.2.8分析方法

6.3结果与讨论

6.3.1硫酸铵沉淀eGFP

6.3.2体积排阻色谱纯化结果

6.3.3阴离子交换色谱实验结果

6.3.4 eGFP的光谱性质

6.4小结

第七章膨胀床分离绿色荧光蛋白的初步探索

7.1前言

7.2实验材料与方法

7.2.1实验试剂

7.2.2实验设备

7.2.3缓冲液的配制

7.2.4 eGFP粗品的制备

7.2.5 pH值对eGFP荧光特性的影响

7.2.6 pH值对Streamline DEAE吸附eGFP的影响

7.2.7 Streamline DEAE的预处理与装柱

7.2.8膨胀床吸附操作步骤

7.3结果与讨论

7.3.1 pH值对eGFP荧光强度及Streamline DEAE吸附eGFP的影响

7.3.2 Streamline DEAE的膨胀性能

7.3.3膨胀床纯化eGFP操作条件的探讨

7.4小结

第八章结论与展望

8.1结论

8.2展望

参考文献

攻读博士学位期间发表论文

附录

致谢