工程化改造酮古龙酸杆菌强化混菌间的互作关系

摘要

强化酮古龙酸杆菌( Ketogulonigenium vulgare)与伴生菌 Bacillus sp.之间相互作用关系是优化维生素 C工业生产的重要研究方向。本文通过工程化改造 K. vulgare构建高产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）菌株以促进其与伴生菌之间的相互作用，提高混菌体系发酵水平。 一方面，本研究通过表达编码高丝氨酸激酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、组胺醇磷酸酶基因来重构K. vulgare缺失的苏氨酸、脯氨酸、组氨酸生物合成路径。经单菌摇瓶发酵验证，发现表达来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的高丝氨酸激酶重组菌 SyBE_Kv02080002生物量最佳且2-KGA产率提高25.13%；当配合伴生菌内生芽胞杆菌(B. endophyticus)混菌发酵时，发酵周期缩短16.67%；之后在5-L发酵罐中进行混菌发酵时，发酵周期缩短28.57%。同时，我们也在细胞形态和基因表达水平方面探索了重组菌SyBE_Kv02080002高产2-KGA的机理。通过扫描电镜观测，重组菌在细胞形态上变为原来的2倍左右。与此同时，转录水平分析表明重组菌膜上与2-KGA生成相关的酶如山梨酮／艾杜糖酸脱氢酶活性相比原始K. vulgare分别提高3.78倍和1.54倍。 另一方面，在K. vulgare中表达来源于G. oxydans的硫辛酸合成模块后发现重组菌产酸能力略优于外源添加硫辛酸，相比原始 K. vulgare产酸量提高了5.25%。在5-L发酵罐中进行单菌发酵时，周期缩短5 h左右。当配合伴生菌B. endophyticus和B. thuringiensis混菌发酵时，2-KGA的产量分别高于原始混菌体系7.4%和3%左右。通过基因转录分析发现，编码以硫辛酸为辅酶的蛋白如酮酸脱氢酶复合体（E2）亚基和甘氨酸剪切系统（H）的基因在重组菌内的转录水平分别为原始菌株的2.54倍和2.51倍。最后我们通过对两类伴生菌胞外代谢物测定以比较不同伴生菌的伴生作用，发现两类伴生菌分泌的胞外代谢物种类和数量各异，因此与产酸菌K. vulgare配合发酵时，两类伴生菌与K. vulgare相互作用和协助产酸能力不同。

目录

声明

前言

第1章文献综述

1.1维生素混菌体系研究进展

1.2维生素C生产中K. vulgare-Bacillus混菌体系研究进展

1.3运用基因工程手段改造微生物氨基酸和硫辛酸路径的研究

1.4本课题的研究意义及主要内容

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.2 K. vulgare菌株改造过程

2.3发酵培养与产物测定

2.4细胞形态与细胞结构观测

2.5代谢组学实验与分析方法

第3章通过氨基酸路径在K. vulgare中重构强化混菌互作关系

3.1引言

3.2酮古龙酸杆菌不同氨基酸路径的分析与重构

3.3 不同氨基酸路径的重构对K. vulgare单菌发酵性能的影响

3.4 苏氨酸路径重构对K. vulgare-B. endophyticus混菌发酵性能的影响

3.5 苏氨酸路径的重构对K. vulgare细胞形态和基因表达的影响

3.6 重构苏氨酸路径对酮古龙酸杆菌代谢的影响

3.7小结

第4章通过硫辛酸模块在K. vulgare中的构建加强混菌互作关系

4.1 引言

4.2硫辛酸功能模块在酮龙酸杆菌中的构建

4.3硫辛酸模块对酮古龙酸杆菌混菌生长和产酸的影响

4.4小结

第5章结论与展望

5.1 结论

5.2展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢