哺乳动物细胞HEK293-F瞬时表达人IL-4

摘要

自1982年美国FDA批准首个基因工程药物——重组人胰岛素上市之后，以重组蛋白药物为首的基因工程药物在近三十年来发展迅速。由于哺乳动物细胞能对蛋白进行正确的折叠组装和翻译后修饰，这对于蛋白维持构象的稳定和生物活性的发挥是至关重要的，因此哺乳动物表达系统成为生产重组蛋白药物的首选工具。瞬时表达系统以其生产周期短，效率高，低投入的特点成为表达研发过程中的药物蛋白候选基因或是结构、功能不明确的蛋白基因的最佳选择，是一种快速、便捷的蛋白表达方法。
　　 虽然瞬时表达系统广泛用于重组蛋白药物的筛选和蛋白功能的研究，但是相对于原核表达系统前者在蛋白表达水平上还是远远落后的。因此需要深入研究如何提高瞬时表达系统的蛋白表达量。
　　 白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)是免疫系统效B和T淋巴细胞等效应细胞成熟分化所必需细胞因子，除了在介导炎症过敏反应中发挥作用外，在肿瘤、自身免疫等疾病的治疗和研究中都有重要作用。天然人IL-4分子为由129个氨基酸(15 kDa)构成的蛋白质，糖基化在其肽链骨架上的2个糖基化位点引入，分子内二硫键由其肽链上的6个半胱氨酸参与。目前基因重组IL-4主要是采用E.coli表达，为非糖基化蛋白质，虽然保留了生物活性，但其活性和稳定性应该与其糖基化形式有很大差异。另外，采用动物细胞表达，由多个半胱氨酸参与的分子内二硫键形成不存在错配问题。
　　 本文以人IL-4作为研究对象，首先克隆构建了人IL-4真核表达载体，将几种分泌能力强的信号肽编码序列通过PCR方法与IL-4基因融合，它们分别为鼠抗体kappa轻链可变区的信号肽--Ig k-chain signal peptide，海洋桡足动物的荧光素酶的信号肽--Gaussia luciferase signal peptide，和一种人工信号肽，构建了一系列带有不同信号肽的表达载体。将这几种表达载体通过PEI介导的瞬时转染在HEK293-F细胞中进行表达，对信号肽进行优化。用ELISA的方法来定量检测IL-4的分泌表达量，得出结果荧光素酶信号肽分泌表达IL-4的能力最强。
　　 然后选取荧光素酶信号肽构建的表达载体，采用Box-Behnken设计对瞬时转染条件进行优化，通过15组不同组合的实验和响应曲面分析(RSM)建立了DNA浓度，PEI浓度和孵育时间三个影响因子与IL-4表达量之间的多元线性回归模型：
　　 Y=198.02+32.77*A-54.25*B-7.90℃-4.55*A*B-4.68*A℃+11.47*B*C+2.74*A2-117.19*B2-1.81℃2(R2=0.9522)。优化出瞬时转染的最佳转染条件为：PEI浓度是6.1μg/mL，DNA浓度为1.96μg/mL，孵育时间为6.07 min。
　　 最后通过RSM与non-RSM法优化出的转染条件在150 mL摇瓶中进行对比实验，结果显示RSM法优化的转染条件能获得更大的IL-4蛋白表达量。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 综述

第一节 引言

第二节 瞬时表达系统

1.2.1 宿主细胞系

1.2.2 转染方法

第三节 真核基因的表达

1.3.1 转录调节

1.3.2 翻译调节

1.3.3 载体的构建

1.3.4 信号肽的优化..

第四节 本研究的目的、主要内容及意义

第二章 IL-4信号肽的优化

第一节 引言

第二节 材料和方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

第三节 结果与讨论

2.3.1 表达载体

2.3.2 重组表达载体的构建

2.3.3 三种信号肽载体的构建

2.3.4 信号肽的筛选

第四节 小结

第三章 转染条件的优化

第一节 前沿

第二节 材料和方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

第三节 结果与讨论

3.3.1 转染条件的优化

3.3.2 瞬时表达

第四节 小结

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历