水稻T-DNA插入突变体筛选以及花发育与生育期相关突变体的研究和基因克隆

摘要

水稻是重要的粮食作物，由于其基因组较小和易于转化等特点，使之成为对禾谷类作物研究的模式作物。随着水稻基因组测序的完成，后基因组(功能基因组和蛋白质组研究)时代的到来，研究人员利用不同的方法创建了大量的水稻突变体，尤其近年来创建了大量的水稻T-DNA插入突变体。这类突变体由于含有特定的T-DNA序列，将这些具有特定序列的T-DNA作为探测基因的标签，为分离特定功能的基因提供了方便。本研究通过对利用粳稻品种中花11号作为受体亲本构建的T-DNA插入突变体库进行了筛选、鉴定和分析和相关基因的克隆，得到以下主要结果： 1.本研究通过对获得的转T-DNA的中花11再生植株以及衍生系进行了田间性状调查以及筛选，共获得了1071个表型变异的稳定株系，并对其中的450个株系利用PCR技术进行了分子检测，发现有173个株系含有T-DNA插入，突变表型包括抽穗期、株高、叶色、叶形、株型、有效穗、花发育以及粒型等突变体； 2.本研究采用TAIL-PCR和Adaptor-mediated nested PCR(也称为PCR步行)两种方法扩增得到了部分中花11突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列；两种方法的扩增效率比较表明，Adaptor-mediated nested PCR方法获得侧翼序列的效率较高、特异性更强。 3.本研究通过对中花11 T-DNA插入突变体的筛选，获得的一份迟熟突变体，表型观察发现该突变体除生育期延长外，同时千粒重变小、根系变短；遗传分析表明相关性状受一对基因控制，且表现为共显性。对Adaptor-mediated nested PCR获得的侧翼序列进行测序和序列比对，发现T-DNA插入到该基因的推断性的最后一个外显子中，编码一个推断性的早花基因，命名为early flowering3(Ef3)。该基因位于第1染色体上，编码一种推断性单铜氧化酶前体(monocopper oxidase precursor)。通过基因组和已克隆相关基因的DNA序列和功能比较，认为Ef3为一个水稻控制抽穗期的新基因。在此基础上，本研究已构建了该基因的功能互补表达载体和2个RNA干涉相关的siRNA载体，功能验证的工作正在进行中。 4.本研究对中花11T-DNA插入过程中组培产生的一个水稻花发育突变体进行了遗传分析和细胞学观察。该突变体表现为花药短小、扭曲并且呈白色透明状，突变性状受一对显性基因控制。显微观察发现，该突变体的花药壁仅有一层规则的表皮细胞层和杂乱无章的PMC或类PMC细胞组成，没有看到规则的内层细胞、中间层、绒毡层和胼胝质的积累。在5期时，突变体的PMC或者类PMC细胞开始液胞化，花粉母细胞不能进入减数分裂。在该突变体的胚珠中观察到至少7个孢原细胞或类孢原细胞，和正常发育的内外珠被，孢原细胞能够分化出大孢子母细胞，并且至少观察到4个大孢子母细胞。同时大孢子母细胞能进入减数分离产生有大孢子。在利用野生型的花粉对该突变体进行授粉时，该突变体能够结实，表明在产生的大孢子中至少有一个具有正常功能。由于花药的内层细胞、中间层、绒毡层以及胚珠的营养细胞和孢母细胞分别起源于相应原基的L2层，因此我们将该突变体命名为ladl突变体。

目录

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摘要

第一章文献综述

1水稻基因组研究进展

1.1遗传图谱的构建

1.2物理图谱的构建

1.3水稻基因组测序

2水稻突变体库的创建

2.1突变体创建的方法和途径

2.2突变机制

2.3水稻插入突变体库的研究进展

3 T-DNA整合的机理及分布特征

3.1 T-DNA整合的机理

3.2 T-DNA插入在基因组上的的分布特征

3.3 T-DNA整合的复杂结构

4 T-DNA插入突变体的研究策略和方法

4.1研究策略

4.2研究方法

5水稻生育期研究进展

6花发育研究进展

6.1花发育的模型的发展

6.2花发育的“四聚体模型”

7研究目的和意义

第二章水稻T-DNA插入突变体的筛选

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1水稻转化植株的分子检测

2.2表型变异的植株性状分析

2.3对表型变异较大材料的遗传背景分析

2.4 T-DNA插入位点侧翼序列的获得

3讨论

3.1突变体表型分布

3.2综合性状突变体的可能机制

3.3两种扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法的比较

第三章一个水稻迟熟T-DNA插入突变体基因的克隆

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1迟熟突变体性状调查与遗传分析

2.2突变性状与T-DNA的共分离分析

2.3该T-DNA插入突变体侧翼序列的获得

2.4序列比对以及基因结构分析

2.5基因功能的预测分析

2.6目的基因的PCR扩增

2.7重组表达载体的构建

2.8 siRNA的设计

2.9重组RNA干涉载体的构建

2.10遗传转化

3讨论

3.1 EF3基因与Hd3a和拟南芥中的FT的关系

3.2 EF3蛋白的可能作用特点

第四章一个水稻花发育突变体的细胞学观察

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1对突变体lad1的筛选和遗传分析

2.2对lad1突变体花药的表型观察

2.3对lad1突变体胚珠的表型观察

3讨论

3.1 lad1突变体和影响细胞分化的其他的突变体

3.2水稻中LAD1基因的功能

附录

参考文献

致谢

发表论文情况