虎源HN亚型流感病毒HA基因与NP基因核酸疫苗和重组腺病毒活载体疫苗的实验研究

摘要

[目的]构建能够分别表达虎源H5N1亚型流感病毒血凝素(HA)基因和核蛋白(NP)基因的真核表达质粒以及表达HA和NP蛋白重组犬2型腺病毒(CAV-2)活载体疫苗（CAV-2-HA和CAV-2-NP），用所构建的真核表达质粒和活载体疫苗免疫小鼠，检测各质粒和活载体疫苗的免疫水平及其攻毒保护率，通过本实验为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗和重组活载体疫苗的应用研究提供理论与技术基础。
　　 [方法]利用设计合成的HA和NP引物，从A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的鸡胚尿囊增殖液中对该毒株的HA和NP基因进行PCR扩增、克隆和测序分析；应用常规分子生物学方法，构建能够分别表达H5N1亚型流感病毒HA和NP基因的真核表达质粒pVAX-HA和pVAX-NP以及同时表达猫IL-18基因和H5N1亚型流感病毒NP/HA基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP，应用间接免疫荧光和间接ELISA方法检测各真核表达质粒在乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21)中的表达情况。
　　 然后将含有NP/HA基因的表达盒(CMV+NP/HA+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处，分别获得含有NP/HA表达盒的穿梭载体pVAX△E3-NP/HA。用SalⅠ+Nru1分别对pVAX△E3-NP/HA和pPoly2-CAV2进行双酶切，将含有NP/HA表达盒的片段定向克隆入pPoly2-CAV2，获得在E3区缺失处插入NP/HA表达盒的重组质粒pCAV-2-NP/HA。释放CAV-2-NP/HA重组基因组，脂质体介导转染犬肾细胞(DK)，获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的重组病毒(CAV-2-NP/HA)。从形态学、基因组水平、NP/HA基因的转录、NP/HA蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。
　　 用所构建的4种真核表达质粒和2种重组病毒分别进行小鼠免疫实验和攻毒保护实验。真核表达质粒的免疫实验共设pVAX-HA、pVAX-NP、pVAX-HA和pVAX-NP联合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合、PBS对照7个免疫组，每组11只小鼠，采用肌肉注射的方法，以15天的时间间隔免疫3次后15天，用间接ELISA方法检测各免疫组小鼠产生的抗AIV的抗体水平；用MTT法检测各免疫组小鼠产生的细胞免疫水平；用H5N1亚型流感病毒强毒株滴鼻攻毒，检测各免疫组的攻毒保护率。
　　 重组病毒的免疫实验共设CAV-2-HA、CAV-2-HA和CAV-2-NP联合免疫、CAV-2三组，每组13只小鼠。采用滴鼻(50μL)+皮下注射(250μL)的免疫方法，以14天的时间间隔共免疫接种2次。每次免疫后14天，每组各扑杀2只采血收集血清，剩下9只中3只用于攻毒后4天处死，测定攻毒后肺滴度，剩余6只用于检测攻毒后的保护率。[结果]成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的HA和NP全基因，长度分别为1704bp和1479bp，分别编码568和493个氨基酸。成功构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的4种真核表达质粒(pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP)和2种重组病毒(CAV-2-HA和CAV-2-NP)。
　　 这4种真核表达质粒均能在BHK-21细胞中表达具有生物活性的HA和NP蛋白，均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫，各免疫组小鼠在受到超大剂量（10000MLD50/只）的强毒攻击后，各组免疫保护率分别为：pVAX-HA组60％、pVAX-NP组20％、pVAX-HA和pVAX-NP联合组60％、pIRES2-IL-18-HA组20％、pIRES2-IL-18-NP组0％、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合组20％、PBS对照组0％。
　　 CAV-2-NP/HA具有典型的CAV-2形态特征，CAV-2-NP/HA在繁殖的过程中没有对H5N1NP/HA表达盒片段进行缺失或重排，并且能够转录H5N1NP/HA的mRNA，ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP/HA单克隆抗体所识别，在体外具有良好的遗传稳定性。动物免疫实验表明CAV-2-HA、CAV-2-NP两种重组活载体疫苗均能诱导小鼠产生特异性的免疫反应，以CAV-2-HA效果最好，对小鼠的攻毒保护率为83.3％，CAV-2-HA和CAV-2-NP联合免疫的保护率为16.7％，对照组(CAV-2)为0％。[结论]本实验首次成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007毒株的HA和NP全基因：首次成功构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的4种核酸疫苗和2种重组犬2-型腺病毒活载体疫苗，它们均能诱导小鼠产生免疫保护作用，这为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗和重组活载体疫苗的应用研究奠定了理论与技术基础。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

符号说明

前言

第一篇 文献综述

第一章 禽流感病原学及流行病学研究进展

1 流感病毒概述

2 禽流感病毒病原学特点

3 H5N1亚型禽流感流行现状

4 H5N1亚型流感病毒的进化

5 结语

第二章 核酸疫苗研究进展

1 核酸疫苗概述

2 核酸疫苗的发展简史

3 核酸疫苗的免疫机理

4 增强核酸疫苗免疫效果的方法

5 核酸疫苗在畜禽领域的研究进展

6 核酸疫苗存在的问题与展望

第三章 犬腺病毒载体的研究进展

1 CAV分子生物学特征

2 CAV载体的研究进展

第二篇 研究内容

第一章 虎源H5N1亚型流感病毒HA与NP基因的克隆、测序及其核酸疫苗的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二章 表达虎源H5N1流感病毒NP和HA蛋白重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三章 核酸疫苗与重组活载体疫苗的小鼠免疫与攻毒保护性试验

实验一 核酸疫苗的小鼠免疫与攻毒保护性试验

实验二 重组活载体疫苗的小鼠免疫与攻毒保护试验

第四章 结论

第五章 创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和出版教材