家兔4种具有相似呼吸道病变疾病的多重RCR检测方法建立

摘要

家兔呼吸道传染病发病率高，波及范围广，造成的经济损失大，尤以兔肺炎克雷伯氏菌病（Klebsiella pneumonia disease，KPD）、兔瘟(兔出血症、Rabbithemorrhagic disease，RHD)、兔多杀性巴氏杆菌病(Pasteurellosis)和兔支气管败血波氏杆菌病(Bordetellosis)发病率高，危害大。由于它们具有相似的临床表现与病理变化，给准确诊断带来了困难。为了能及时、准确、快速诊断家兔这4种具有相似病变的疾病，本实验建立了一种能够同时检测这4种病原的MPCR方法。
　　根据GenBank中的肺炎克雷伯菌（KP.）的16S rRNA V2可变区基因、兔瘟病毒(RHDV)的VP60基因、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的ktm1基因和支气管败血波氏杆菌（B.bronchiseptica）的ptxA基因，设计4对引物，序列分别为 P1: AGCACAGAGAGCTTG; P2: ACTTTGGTCTTGCGAC; P3:TCGCTCAACAACTACTCG;P4: TAGTTGCAGCTCTTGCCT;P5:ATCCGCTATTTACCCAGTGG;P6:GCTGTAAACGAACTCGCCAC; P7:GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG; P8: ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG,分别扩增长度为127bp、322bp、457bp和872bp的特异性片段。对影响MPCR反应的六大因素（包括退火温度、引物浓度、dNTP Mixture浓度、Mg2+浓度、rTaq添加量和循环次数）进行优化，建立了MPCR检测方法，优化后25μL体系为10×PCR Buffer(Mg2+ Free)2.5μL; dNTP Mixture(2.5mM each)0.5μL; Mg2+(25mM)1.5μL; Primer Mix(12.5mM each)4.0μL; Template DNA/cDNA of Sample4.0μL;rTaq(5U/μL)0.5μL; ddH2O12.0μL。反应参数为95℃5min;94℃50s，56.8℃40s，72℃1min，30个循环;72℃10min;4℃保存。MPCR产物按5比1混合6×loading Buffer经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　特异性试验发现，该方法仅与相对应模板发生特异性扩增，而与兔源金黄色葡萄球菌、兔源无乳链球菌、兔源粪肠球菌、兔魏氏梭菌及蒸馏水空白对照未发生扩增反应。该MPCR方法对于4种病原的检测灵敏度分别可达9.16×10-3 ug/ml、7.24×10-6 ug/ml、7.96×10-3ug/ml和6.8×10-4 ug/ml。对于人工感染病例的检测，检测结果表明该方法能够很好的检测出相应的单一或混合病原。同时检测兔肺炎克雷伯氏菌病、兔瘟、兔多杀性巴氏杆菌病和兔支气管败血波氏杆菌病耗时约5小时，其灵敏度、特异性、稳定性和高效性远优于传统的细菌分离培养检测方法，可运用于临床诊断。

目录

论文说明

声明

摘要

第一部分 文献综述

1．国内家兔养殖现状

2．家兔呼吸道疾病的病因

2．1 生物性因素

2．2 非生物性因素

3．家兔主要呼吸道疾病的临床表现与病理变化

4．家兔呼吸道疾病的诊断方法

5．多重PCR(MPCR)技术概述

第二部分 实验部分

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 模板和引物制备

1．3 多重PCR(MPCR)检测方法的优化和确立

1．4 多重PCR(MPCR)方法的特异性和灵敏度试验

1．5 多重PCR(MPGR)方法的临床检测试验

2．结果

2．1 多重PCR(MPCR)检测方法的优化和确立

2．2 多重PCR(MPCR)方法的特异性和灵敏度试验

2．3 多重PCR(MPCR)方法临床检测实验

3．讨论

3．1 家兔呼吸道疾病危害及其诊断

3．2 多重PCR(MPCR)技术及其应用

3．3 多重PCR(MPCR)引物的设计

3．4 多重PCR(MPCR)反应条件的优化

4．结论

参考文献

致谢