表达IBV S1蛋白抗原表位的含鸡源启动子的真核表达质粒的构建及其免疫原性检测

摘要

真核表达载体中表达外源基因的组件主要包括:(1)启动子和增强子;(2)转录、终止信号;(3)加polyA信号;(4)选择或筛选标记。启动子和增强子具有种属和组织特异性，其作用在不同来源的细胞中有很大区别。为研究启动子对真核表达系统表达外源基因的影响，构建专门适用于鸡体内进行外源基因表达的真核表达载体，本试验将真核表达载体pcDNA3.1和pCIneo的CMV启动子替换为鸡β-actin启动子，并对IBV ZY3株的S1蛋白抗原表位基因进行真核表达。主要试验内容有:
　　根据GenBank中β-actin启动子（登录号为:DI038975）的基因序列设计引物，在上、下游引物5'端分别引入适用于克隆至两种真核质粒pcDNA3.1和pCIneo的酶切位点。提取鸡淋巴细胞基因组DNA作为模版，通过PCR扩增获得鸡β-actin启动子序列，并用β-actin启动子替换掉pcDNA3.1和pCIneo中的CMV启动子，获得重组真核表达载体pcDNA-act和pCIneo-act。将EGFP基因克隆至载体的多克隆酶切位点中，获得含有EGFP报告基因的重组质粒pcDNA-EGFP，pcDNA-act-EGFP，pCIneo-EGFP和pCIneo-act-EGFP。将4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，24 h后通过荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示:在转染CEF24 h后，pcDNA-act-EGFP和pCIneo-act-EGFP转染的细胞中可观察到荧光，而pcDNA-EGFP和pCIneo-EGFP转染的细胞中36h后才可见荧光，4种质粒转染的细胞均在5d后达到最大表达量。启动子替换后的重组质粒在转染细胞中的绿色荧光蛋白的表达量明显多于未替换启动子的重组质粒。
　　根据IBV ZY3株S1蛋白抗原表位基因序列设计引物，以含S1蛋白抗原表位基因的质粒PMD19-S1为模版扩增S1蛋白抗原表位基因，并将其分别亚克隆至启动子替换前后的真核载体中，获得含S1蛋白抗原表位基因的重组质粒pcDNA-S1，pcDNA-act-S1，pCIneo-S1和pCIneo-act-S1。将重组质粒转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)中，采用间接免疫荧光法检测转染细胞中S1蛋白的表达，结果显示启动子替换后的真核质粒转染细胞中S1蛋白的表达量明显多于未替换启动子的转染细胞。为检测以上4种真核表达质粒的免疫原性，将重组质粒对7日龄SPF雏鸡进行首免，21日龄二免，同时设立IBV灭活疫苗组及PBS空白对照组。采用间接ELISA试验检测首免后7、14、21、28天的血清中IBV特异性抗体。首免后28天，用IBV ZY3病毒株对各组进行攻毒，统计发病和死亡情况，攻毒14天后，处死所有试验鸡并观察和统计各组的剖解病变情况。结果显示:以上4种质粒免疫鸡的血清中均可检测到IBV特异性抗体，启动子替换质粒组的抗体效价在首免后的4个时间点均比启动子未替换质粒组高，且差异显著(P＜0.05); pCIneo-act-S1免疫组的抗体水平在4个质粒免疫组中始终最高，且除一免后2周外，其余时间点均比灭活疫苗组高;启动子替换质粒免疫组攻毒后的发病率和死亡率均比启动子未替换质粒免疫组和灭活苗免疫组低。
　　综上所诉，含有鸡源型启动子的载体在鸡细胞内的表达能力明显高于含非鸡源型启动子的载体，说明启动子和表达载体的同源性对外源基因的表达水平具有显著的影响。本研究构建的含鸡源型启动子的真核表达载体将对鸡的基因表达及IB核酸疫苗研制提供新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略词对照表

第一部分 文献综述和选题目的及意义

1 禽传染性支气管炎概况

1．1 IBV病原特征

1．2 基因组结构

1．3 IBV主要结构蛋白及其生物学功能

2 IB流行病学研究

2．1 IBV的分子变异机制

2．2 IB国外流行情况

2．3 IB国内流行情况

3 IB疫苗的研究

3．1 IB灭活疫苗

3．2 IB弱毒疫苗

3．3 IB基因工程疫苗

4 研究目的及意义

第二部分 试验内容

第一章 含鸡源启动子的真核表达载体的构建及其表达能力检测

1 材料

2 方法

3 结果

4．讨论

第二章 IBV S1蛋白抗原表位的真核表达及免疫原性检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录