CSF V和PCV2感染后免疫抑制性受体转录水平研究及阻断猪PD-1/PD-L1通路多肽基序鉴定

摘要

免疫抑制性受体传递免疫抑制和免疫耐受信号，是获得性免疫调节的重要分子，包括程序性死亡因子1（programmed death-1，PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等。多种慢性或持续性病毒感染过程中，PD-1、CTLA-4或LAG-3等过量表达，活化免疫负调节信号通路，引起免疫细胞凋亡、增殖能力降低以及抗病毒细胞因子分泌减少等，造成机体免疫功能损伤或免疫抑制，阻断PD-1、CTLA-4、LAG-3与其相应配体相互作用，可以逆转T细胞免疫功能。猪瘟（classical swine fever,CSF）和断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)是猪的两种重要传染性疾病，目前对CSF和PMWS引起免疫功能损伤或免疫抑制的致病机制已经从病原和宿主两方面进行了深入广泛的研究，但是，在宿主效应细胞免疫调节方面研究较少，免疫抑制性受体是否参与CSF和PMWS的免疫致病机制尚未见报道。因此，本课题旨在研究CSF和PMWS感染过程中免疫抑制性受体的转录水平及其对免疫效应影响，筛选和鉴定能阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序，以期进一步揭示CSF和PMWS的免疫致病机制，为研究免疫调节药物和佐剂提供理论基础。
　　PD-1/PD-Ls通路活化是多种病毒性疾病造成免疫损伤的重要致病机制。本部分主要研究CSFV感染猪后PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的转录水平变化。45日龄CSFV抗体阴性仔猪感染CSFV石门株，分成两组:感染组（10头）和对照组（5头），颈部肌肉注射105×TCTD50的CSFV/头，对照组注射0.5 mL的PBS，感染后0d、3d、7d、10d、14d和21 d，颈静脉采集抗凝血5 mL，分离猪外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)，实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qPCR)检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、IL-2、IL-10的转录水平，同时检测血浆中CSFV载量，用CFSE标记PBMCs，rswIL-2和CD3单抗刺激，测定T细胞的增殖能力。结果显示，在感染后第3 dPD-1和PD-L1转录水平开始升高(p＜0.05)，第7d达到峰值(p＜0.01)，而PD-L2转录水平在感染后3d达到峰值(p＜0.01)，之后开始降低。血浆中CSFV载量在感染后第7d达到峰值，PD-1及其配体转录水平与CSFV载量成正相关。免疫负调节细胞因子IL-10转录水平在感染后7d显著升高(p＜0.01)，IL-2转录水平在PD-1及其配体转录水平下降之后即感染后14d显著升高(p＜0.05)，感染后第7d，T细胞增殖能力降低。结果表明CSFV感染能够引起PD-1/PD-Ls通路改变。
　　选取河南新乡地区某规模化养猪场疑似患PMWS的断奶仔猪9头，临床症状表现为渐进性消瘦或生长缓慢、厌食、精神沉郁、皮肤苍白、被毛蓬乱、咳嗽和呼吸困难等，健康对照组6头，PCR检测血浆、肺脏和脾脏中病原PCV2、PRRSV、PPV、PRV和CSFV，采集猪抗凝血5mL/头，采集抗凝血2次，间隔7d，分离PBMCs，qPCR检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、PTEN以及细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的转录水平，流式细胞术检测PBMCs的增殖能力。结果显示，发病猪的血浆、肺脏和脾脏中分别扩增出PCV2381 bp特异性目的条带，未扩增出PRV、PPV、PRRSV和CSFV的特异性目条带，根据临床症状和病原检测，确诊发病猪患PMWS。PD-L1(p＜0.01)和PD-L2(p＜0.05)转录水平显著升高，而PD-1、CTLA-4和LAG-3的mRNA水平无显著变化，PTEN的mRNA水平显著升高(p＜0.01)，PTEN表达量升高证实PD-1/PD-Ls通路的活化，而且PD-L1还可以与B7分子结合抑制B7与CD28分子的结合，阻断共刺激信号B7/CD28通路，抑制T细胞活化;IL-10转录水平显著升高(p＜0.01)，IL-2和IFN-γ轻微升高，但是统计学分析不显著，PBMCs增殖能力显著降低。结果表明自然感染PMWS过程中可以引起PD-/PD-Ls通路改变，抗病毒细胞免疫功能降低，进一步揭示PMWS的免疫致病机制。
　　根据PD-1与其配体复合物的三维结构与结合位点，设计合成包含PD-1与PD-L1结合位点的系列多肽，初步探讨合成多肽阻断PD-1/PD-L1通路的免疫调节。分离患PMWS猪的PBMCs，CFSE标记细胞，多肽与ConA共同刺激培养3d，流式细胞术检测PBMCs的增殖变化;选取能促进PBMCs增殖的多肽标记FITC，检测标记多肽与猪重组蛋白PD-L1及PBMCs的结合情况;选取能结合猪PD-L1蛋白的多肽与灭活CSFV共同免疫小鼠后，检测血清中CSFV的抗体水平。结果显示，多肽PD-15能显著提高猪PBMCs增殖能力。并且PD-15能有效结合重组蛋白PD-L1和PBMCs，多肽PD-15与灭活CSFV共同免疫小鼠后，CSFV抗体水平显著升高。结果表明多肽PD-15能阻断猪PD-1/PD-L1通路，促进PBMCs增殖和提高抗体水平，为研制新型免疫调节佐剂奠定基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．免疫抑制性受体的研究进展

1．1 PD-1及其配体的发现和结构鉴定

1．2 PD-1／PD-Ls分子传导通路

1．3 PD-1和PD-Ls的表达和调节

1．4 PD-1／PD-L1通路与病毒感染

1．5 免疫抑制性受体CTLA-4和LAG-3的研究进展

1．6 猪免疫抑制性受体的研究进展

2．猪瘟致病机制研究进展

2．1 猪瘟

2．2 猪瘟病毒

2．3 CSFV免疫致病机制

3．断奶仔猪多系统衰竭综合征致病机制研究进展

3．1 断奶仔猪多系统衰竭综合征

3．2 PMWS病原

3．3 PMWS免疫致病机制

4．本课题研究目的与意义

第二章 猪感染CSFV后PD-1及其配体转录水平研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 病毒、细胞和试验动物

2．2 主要生物学试剂

2．3 主要溶液配制

2．4 主要仪器

2．5 CSFV的繁殖及TCID50的测定

2．6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测目的基因mRNA方法的建立

2．7 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立

2．8 检测CSFV感染过程中PD-1与其配体转录水平及免疫效应变化

3．结果与分析

3．1 CSFV鉴定与TCID50的测定

3．2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及细胞因子IL-2、IL-10标准曲线的建立

3．3 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立

3．4 人工感染CSFV

3．5 感染CSFV过程中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA转录变化

3．6 感染CSFV过程中IL-2和IL-10 mRNA转录变化和T细胞增殖能力的检测

3．7 血浆中CSFV载量

4．讨论

4．1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达

4．2 细胞因子IL-2和IL-10表达及T细胞增殖能力

4．3 CSFV载量

5．小结

第三章 自然感染PCV2后免疫抑制性受体转录水平研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 主要生物学试剂

2．2 主要溶液配制

2．3 主要仪器设备

2．4 试验动物

2．5 qPCR引物设计与合成

2．6 qPCR检测目的基因方法的建立

2．7 自然感染PCV2过程中主要免疫抑制性受体及细胞因子转录水平研究

3．结果与分析

3．1 qPCR检测CTLA-4、LAG-3、PTEN及细胞因子IFN-γ标准曲线的建立

3．2 PMWS的病原检测

3．3 qPCR检测主要免疫抑制性受体的基因转录水平

3．4 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化

3．5 PBMCs增殖

4．讨论

4．1 病原检测

4．2 PCV2感染后免疫抑制性受体和配体的表达

4．3 PCV2感染后细胞因子表达与PBMC增殖

5．小结

第四章 阻断猪PD-1／PD-L1通路的多肽基序鉴定

1．引言

2．材料与方法

2．1 主要试剂及免疫动物

2．2 主要溶液配制

2．3 主要仪器设备

2．4 固相法合成多肽基本流程

2．5 多肽设计

2．6 固相法合成多肽程序

2．7 多肽的溶解

2．8 多肽标记FITC

2．9 多肽PD-15阻断PD-1／PD-L1通路促进PBMC增殖能力

2．10 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合

2．11 FITC标记多肽与PBMC结合

2．12 多肽PD-15作为佐剂免疫效果评价

3．结果与分析

3．1 多肽PD-15阻断后对PBMCs增殖影响

3．2 多肽PD-15与猎重组蛋白PD-L1的结合

3．3 多肽PD-15与PBMCs结合

3．4 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列

3．5 多肽PD-15对体液免疫的影响

4．讨论

4．1 固相多肽合成

4．2 多肽溶解

4．3 多肽阻断PD-1／PD-L1通路促进PBMCs增殖

4．5 PD-15作为免疫佐剂对抗体水平的影响

5．小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

附录

博士期间发表论文及成果