蔗糖在泸定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的信号作用初探

摘要

泸定百合（Lilium sargentiae Wilson）拥有极高的园林观赏价值、经济价值、食用和药用价值。然而传统的分球繁殖方法存在繁殖系数低、易感染病毒导致百合优良品种退化等问题。在百合生产中，利用离体再生技术能加快百合的繁殖速度，提高繁殖率。然而与自然状态下生长的幼苗相比，采用此方法生长的百合组培苗，在形态、生理等方面均有着较大的差异，移栽后组培苗生长能力更差，不易存活。这些问题的存在已成为我国研究百合鲜切花及种球规模化生产的主要障碍。为解决这个问题，我们可以在试管内结鳞茎并使其膨大，以此达到壮苗和提高移栽成活率的目的。要达到该目的，不仅要研究试管鳞茎膨大的技术，更应该解释清楚膨大的机制是什么。
　　为此，本实验以泸定百合种球的鳞片为外植体诱导形成的无菌丛芽为材料，采用不同浓度的蔗糖(30、60、90、120 g/L)处理，为泸定百合试管鳞茎形成与膨大寻求最适的蔗糖浓度，为生产优质泸定百合种球提供科学技术支撑和实践指导。并进一步通过不同的可溶性糖、渗透势处理、糖类似物及抑制剂处理，测定鳞茎发生和膨大的形态指标及其内源性糖与相关酶变化，研究蔗糖在泸定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的特异性信号功能，以此回答其扮演的角色。为此做了以下实验并得出相应研究结果:
　　1、百合试管鳞茎膨大实验处理及其方案优选结果
　　在整个蔗糖处理梯度中，鳞茎膨大出现随着浓度增加逐渐由低到高的单峰曲线，在60 g/L时达到峰值，之后，随着蔗糖浓度继续提高，鳞茎的膨大效果开始减弱。当蔗糖浓度达到90～120 g/L时，膨大效果减弱至对照处理的水平。所以本实验中，诱导百合鳞茎形成及膨大的最佳蔗糖浓度应为60 g/L。
　　2、渗透势在蔗糖处理过程中是否参与鳞茎膨大作用的实验结果
　　为了研究外源蔗糖对试管鳞茎的形成及膨大作用是否与高浓度蔗糖所产生的渗透势有关，实验用与60 g/L的蔗糖具有相同渗透势的甘露醇来处理材料。结果显示，在相同渗透势条件下，甘露醇诱导泸定百合试管鳞茎形成及膨大的能力极低，不能使鳞茎新增，这与蔗糖处理的效果相比存在显著差异。由此可知，渗透势在糖处理过程中没有参与鳞茎形成及膨大的作用，排除了渗透势的干扰。
　　3、不同可溶性糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的影响结果
　　为了进一步说明蔗糖对鳞茎形成及膨大作用的高效性和主导性，实验用与60 g/L的蔗糖(175.3 mmol/L)相同碳分子含量的不同可溶性糖(350.6 mmol/L葡萄糖、350.6 mmol/L果糖;175.3 mmol/L葡萄糖+175.3 mmol/L果糖)来处理材料。结果表明，在全黑暗条件下，蔗糖对试管鳞茎的形成与膨大的效果最好;果糖+葡萄糖组合处理对鳞茎的形成及膨大的效果次之;而单独的葡萄糖、果糖处理对试管鳞茎的形成及膨大的效果则最弱，但这两者之间的差异不显著;并与蔗糖处理的效果相比均存在显著性差异。根据前人研究认为，用相同碳分子含量的葡萄糖和果糖的单独及组合处理来模拟蔗糖对其影响，当它们模拟效果失败时，就能认为蔗糖作用主要表现为特异性信号作用。由此可初步表明，蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用具有高效性，且这种高效性不完全是通过能源和碳源来实现的，而是通过蔗糖特定的信号途径完成的。
　　4、糖类似物处理对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的影响
　　为了进一步验证蔗糖对泸定百合鳞茎形成及膨大的作用与蔗糖特定的信号途径有关。实验采用糖类似物处理植物材料，结果表明，添加外源3-氧甲基葡萄糖(3-OMG)处理材料后不能诱导试管鳞茎的形成并使其膨大;甘露糖处理后有作用，但其作用效果不如蔗糖，且具有显著性差异，只有异麦芽酮糖处理后效果与蔗糖相近。鳞茎膨大作用由强到弱的顺序是:蔗糖＞异麦芽酮糖＞葡萄糖＞甘露糖＞3-OMG。甘露糖可以通过己糖激酶磷酸化，但它不能被进一步代谢，表示的是己糖激酶参与的信号传导途径。3-OMG是较差的己糖激酶底物，其作用是表示己糖激酶无关的信号通路。异麦芽酮糖是双糖，未在高等植物中合成的，并且不由植物酶裂解或运送，其效果表明蔗糖信号感应在细胞膜水平。此结果可进一步说明，蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用与蔗糖特异性信号有关。
　　5、抑制剂处理对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的影响
　　本实验采用排除法抑制蔗糖等碳源的供给，验证蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的有效性及其信号作用。利用蔗糖特异性吸收抑制剂(pCMBS)和葡萄糖吸收抑制剂根皮苷(phloridzin)阻断蔗糖和葡萄糖的吸收过程。研究结果表现为用pCMBS处理后，蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的能力急剧减弱;pCMBS处理对葡萄糖在定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的效果无明显作用。用phloridzin处理后葡萄糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用最弱，可基本阻断葡萄糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的能力;但其对蔗糖诱导结鳞茎的抑制效应很低。结合pCMBS和phloridzin的作用方式，可推测，在泸定百合鳞茎形成及膨大的过程中，添加的高浓度蔗糖有部分被胞壁转化酶(CWINV)转化形成葡萄糖和果糖，说明添加的外源性蔗糖大部分是依赖自身的特异性载体蛋白直接转运到细胞内的，而其中的一小部分是经转化酶转化成葡萄糖和果糖，再通过己糖转运蛋白转运进入细胞，这部分己糖或己糖信号系统对百合鳞茎的生长发育发挥的作用是极少的。而蔗糖在鳞茎形成及膨大过程中的诱导及膨大的作用主要通过其自身来实现，其高效性与自身特异性载体直接相关。由此可进一步证实，蔗糖在泸定百合鳞茎形成及膨大过程中的作用主要是通过蔗糖独特的信号分子功能来实现的。
　　综上所述，本研究结果表明，蔗糖可以有效促进泸定百合试管鳞茎形成及其膨大，其适宜的浓度为60g/L。在高浓度糖处理过程中渗透势对没有鳞茎形成及膨大没有作用。蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用具有高效性，且这种高效性不完全是通过能源和碳源来实现的，而是通过蔗糖特定的信号途径完成的。因此，蔗糖对泸定百合试管鳞茎形成及膨大的作用与蔗糖特异性信号有关，扮演了信号角色。

目录

声明

缩写表

摘要

前言

1 文献综述

1．1 百合繁殖与鳞茎膨大技术研究现状与进展

1．1．1 百合繁殖方面的现状与进展

1．1．2 百合试管鳞茎形成与膨大技术研究现状与进展

1．2 蔗糖对地下茎膨大作用研究现状

1．2．1 蔗糖对百合鳞茎膨大作用研究现状

1．2．2 蔗糖对其它植物地下部分诱导及膨大作用研究现状

1．3 蔗糖信号研究现状与进展

1．3．1 蔗糖简介

1．3．2 蔗糖合成与代谢

1．3．3 蔗糖信号系统研究现状与进展

1．4 其它糖信号系统研究现状与进展

1．4．1 己糖激酶信号系统研究现状与进展

1．4．2 其他糖信号系统研究现状与进展

1．5 小结

2 拟解决问题及其研究目的意义

3 研究内容和实验设计

3．1 供试材料与培养条件

3．1．1 植物材料与培养条件

3．1．2 实验试剂的选择

3．2 内容与方法

3．2．1 百合试管鳞茎膨大实验处理及其方案优选

3．2．2 渗透势在糖处理过程中是否参与膨大作用的实验

3．2．3 不同可溶性糖的处理实验

3．2．4 糖类似物的处理实验

3．2．5 抑制植物吸收糖的抑制剂处理实验

3．3 测量方法

3．3．1 形态指标测定方法

3．3．2 生理指标测定方法

3．4 数据分析方法

4 结果与分析

4．1 百合试管鳞茎膨大实验处理及其方案优选

4．2 渗透势在糖处理过程中是否参与膨大作用的实验

4．3 不同可溶性糖处理对鳞茎形成和膨大的影响

4．3．1 不同可溶性糖处理对鳞茎形态指标的影响

4．3．2 不同可溶性糖处理对鳞茎内源性糖含量的影响

4．3．3 不同可溶性糖处理对鳞茎SPS、SUSY活性变化的影响

4．4 糖类似物处理对泸定百合鳞茎形成和膨大的影响

4．4．1 糖类似物处理对鳞茎形态指标的影响

4．4．2 糖类似物处理对百合鳞茎内源性糖含量的影响

4．4．3 糖类似物处理对鳞茎SPS、SUSY活性的影响

4．5 抑制剂处理对百合鳞茎形成和膨大的影响

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．1．1 蔗糖对泸定百合鳞茎诱导和膨大的作用的高效性和主导性

5．1．2 蔗糖对泸定百合鳞茎形成及膨大的信号作用

5．2 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章