单去势引起的小鼠睾丸DNA甲基化和基因表达的变化

摘要

睾丸作为哺乳动物繁衍的重要生殖器官，主要负责雄性配子的产生以及固醇类性激素的释放。外力、生化或疾病等因素都可能损伤单侧睾丸并影响其正常的功能，甚至造成生殖障碍。单去势作为一种单侧睾丸摘除手术能够去除受损的睾丸，同时引起剩余睾丸激素的改变和代偿性应答，并且可能影响精子的发生。但是，其中可能存在的分子机制还有待进一步地探讨。
　　因此，本试验中我们将探究单去势对剩余睾丸功能的影响。青春期前的小鼠(24日龄)被实施单去势手术，并且测定小鼠的生长发育相关指标直至它们到达体成熟(72日龄)。接着，我们通过简并代表性亚硫酸氢盐测序技术测定了正常和单去势小鼠剩余睾丸的DNA甲基化模式。同时，我们使用RNA测序技术描绘了睾丸基因的表达模式以探究单去势小鼠基因表达与DNA甲基化之间的关系，并探讨了lncRNA可能通过改变DNA甲基化进而调控生精相关基因的表达。结果如下:
　　(1)相较对照组小鼠，单去势并没有显著影响小鼠的生长或睾酮水平（P＞0.05），小鼠剩余睾丸并没有出现组织学形态结构的变异。
　　(2)剩余睾丸的全基因组DNA甲基化模式表明大量基因在基因体区域含有差异甲基化区域(1，139)，这些基因的功能主要富集于蛋白的结合和细胞黏附。
　　(3)mRNA分析结果显示，46个差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)在单去势组中表达上调，其功能涉及减数分裂细胞循环、联会复合物的装配和精子发生。同时，197个DEGs表达下调，同肽链内切酶抑制剂的活性以及花生四烯酸的代谢通路有关。
　　(4)19个lncRNA出现差异表达，cis和trans分析结果显示lncRNA-9230019H11Rik、lncRNA-Gm13652和lncRNA-Gm30934的功能可能同肽酶抑制剂的活性有关;lncRNA-1700095K22Rik和lncRNA-Gm36525的功能显著富集于氨基酸的跨膜转运;lncRNA-1700061I17Rik、lncRNA-4930432O09Rik和lncrRNA-4930401O12Rik的潜在功能为花生四烯酸的代谢。
　　(5)联合分析显示，负责编码精母细胞同源重组的关键蛋白的基因PSMC3IP(Proteasome26S subunit ATPase3interacting protein)，在单去势小鼠中表现出启动子区域低甲基化且表达水平升高，并且与3个lncRNA(lncrRNA-4930401O12Rik、lncRNA-9230019H1Rik和lncRNA-Gm13652)的表达显著负相关。
　　单去势引起的小鼠睾丸全基因组DNA甲基化的变化与睾丸功能有关，并且调控相关基因的表达以参与精子的发生。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(List of Abbreviations)

1文献综述

1．1单去势的研究进展

1．1．1睾丸功能与调控

1．1．2单去势对于睾丸影响的研究进展

1．2 DNA甲基化对于睾丸功能的影响

1．2．1 DNA甲基化的功能概述

1．2．2全基因组DNA甲基化的检测方法比较

1．2．3甲基化在雄性生育中扮演重要角色

1．3长链非编码RNA对睾丸功能的影响

1．3．1长链非编码讨妊(lncRNA)概述

1．3．2精子发生过程中的lncRNA

2研究的目的意义

3材料与方法

3．1试验材料

3．1．1试验动物

3．1．2试验主要仪器设备

3．1．3主要试剂

3．2主要实验方法

3．2．1单去势小鼠模型的构建

3．2．2小鼠的饲养

3．2．3小鼠的处死取样及相关表型指标的测定

3．2．4小鼠血清睾酮浓度的测定

3．2．5小鼠睾丸的组织学分析

3．2．6小鼠睾丸的DNA抽提

3．2．7RRBS文库的建立与测序

3．2．8小鼠睾丸RNA的抽提

3．2．9RNA-seq文库的建立与测序

3．2．10测序reads质量把控与拼接

3．2．11基因组元件的鉴定

3．2．16RNA-seq的qPCR验证

3．2．17数据的处理与分析

4结果与分析

4．1表型指标的测定

4．1．1小鼠生长发育指标的测定

4．1．2小鼠睾丸的组织学分析

4．2单去势引起了睾丸DNA的差异甲基化

4．3存在DMR的基因同摹丸精子发生有关

4．4小鼠睾丸转录组分析

4．4．1单去势小鼠皋丸mRNA分析

4．4．2单去势小鼠睾丸lncRNA分析

4．4．3 lncRNA与mRNA关联分析

4．5 DMR、mRNA和lncRNA联合分析

5讨论

5．1单去势对小鼠生长发育及睾丸功能的影响

5．2单去势引起睾丸的DNA甲基化变化同精子发生有关

5．3单去势小鼠睾丸转录组维持正常的精子发生

5．4 lncRNA通过DNA甲基化调控蛋白编码基因的表达

6结论

参考文献

致谢

作者简历

附录