DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其应用研究

摘要

DNA损伤与修复一直是毒理学和肿瘤学研究的热点，在众多DNA损伤中，以自由基(freeradical)引起的DNA氧化损伤(oxidativeDNAdamage)研究最多，被认为是启动和促进肿瘤发生最为重要的因素。大量研究表明：活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)自由基可以直接攻击生物大分子DNA，诱发DNA链断裂和多种形式的碱基修饰。在各种DNA氧化损伤中，以鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见，其氧化产物8-羟基-脱氧鸟嘌呤(7，8-dihydro-8-oxoguanine,8-OHdG)在体内形成后较为稳定、易于检测，被公认为DNA氧化损伤的生物标志物(biomarker)。此外，8-OHdG最特征、最具生物学意义的危害是：DNA链中的鸟嘌呤G被氧化成8-OHdG后可导致DNA链空间构象的改变，在DNA合成时8-OHdG优先或等效率地与腺嘌呤A配对，从而导致DNA链G：C-＞T：A颠换，该颠换在肿瘤形成中发生最早，常见于癌基因ras和抑癌基因p53中，故此突变被认为与肿瘤的发生发展、机体细胞的老化和某些退行性疾病的发生都具有密切的关系。 人体细胞中，特异性切除和修复8-OHdG的酶是8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanineDNAglycosylase，简称HOGG1)，具有切除DNA双链中与碱基C配对的8-OHdG的作用，从而恢复基因组中正常的G：C配对，在维持基因组稳定和肿瘤预防上具有举足轻重的作用，编码该蛋白的基因hOGG1于1997年成功克隆。 人群流行病学研究显示：hOGG1基因在不同人群存在遗传多态性，并与癌症易感性密切相关，其突变或缺失将增加个体罹患肿瘤的风险。目前，关于hOGG1基因与环境致癌物作用的报道还不多，研究的物质种类也很有限。此外，有关hOGG1与氧化损伤和癌症的关系的研究结果也不尽一致，有的研究显示外来化合物诱导DNA氧化损伤时，hOGG1表达下降，酶活性降低，组织中8-OHdG增加；而有的报道则相反。目前，国外正在从各个方面蓬勃开展其研究，国内的报道相对较少。本研究拟采用核酶技术和分子克隆技术建立hOGG1基因低表达的细胞株，这将为深入研究DNA氧化损伤和修复以及与癌症的关系提供一个十分有效的毒理学实验工具。 核酶(ribozyme)技术属于反义核酸技术之一，是继基因克隆之后的又一全新分子生物学技术。核酶是一类具有核酸内切酶活性、能序列特异性地剪切mRNA的RNA分子，设计合理的核酶能与被选择的靶mRNA片段特异结合，通过多种机制抑制或封闭目的基因的mRNA表达，使其失去生物学功能。由于核酶所具有的独特优点，近10年来其研究进展十分迅速，特别是在基因治疗领域报道甚多，而毒理学上的应用报道极少。 全文共分四个部分，主要研究内容如下：第一部分：hOGG1基因特异性锤头状核酶真核表达载体的构建和鉴定。应用计算机软件模拟hOGG1的二级结构并辅助设计核酶，采用分子克隆手段将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建hOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体pcDNA3.1(+)-RZ，并经酶切电泳和DNA测序鉴定。 第二部分：hOGG1低表达细胞株的建立及鉴定。运用真核细胞转染的方法，将核酶的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RZ经FuGENE6介导转染人的肺腺癌A549细胞；G418筛选，Neo基因的逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增证实转染成功；RT-PCR半定量检测转染细胞与未转染细胞中hOGG1的表达水平，了解核酶对靶基因的抑制效果。 第三部分：hOGG1低表达细胞株的生物学特性鉴定。通过观察转染细胞的形态、生长特性、细胞周期、细胞基础凋亡率、细胞增殖指数、软琼脂克隆形成率及超氧化物歧化酶(SOD)的活力等，了解hOGG1低表达细胞的生物学特性，为应用奠定基础。 第四部分：低表达细胞株在DNA氧化损伤与修复、药物敏感性和放射敏感性研究中的初步应用。用彗星试验比较重铬酸钾(K2Cr2O7)、过氧化氢(H2O2)、抗肿瘤药物阿霉素(ADM)和60Co-γ射线对转染细胞(命名为A549-R细胞)和非转染细胞(即A549细胞)DNA氧化损伤与修复的差异；MTT试验检测两种细胞在ADM和60Co-γ射线处理后的细胞存活率，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖指数的变化，以了解hOGG1的低表达对细胞的药物敏感性和放射敏感性的影响。主要研究结果如下： 1、应用计算机软件模拟hOGG1的二级结构并辅助设计了60bp的核酶基因，采用分子克隆手段将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，经酶切电泳和DNA序列测定证实核酶基因成功克隆到pcDNA3.1(+)，从而构建了hOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体pcDNA3.1(+)-RZ。 2、用FuGENE6转染试剂将pcDNA3.1(+)-RZ转染人肺腺癌A549细胞，通过G418筛选出阳性转染的细胞克隆，RT-PCR扩增Neo基因证明质粒成功导入靶细胞。转染了pcDNA3.1(+)-RZ的A549-R细胞hOGG1的mRNA表达下降，比未转染的A549细胞降低61.5％，说明核酶基因在细胞内能够转录出核酶，并可有效抑制目的基因hOGG1的表达。 3、hOGG1低表达细胞株的生物学特性鉴定结果表明：在转染初期转染了核酶基因的A549-R细胞形态发生了一定的变化，但这种变化与hOGG1无关，且随时间的延长，两种细胞在形态上逐渐趋于一致。两种细胞的生长特性(群体倍增时间、进入对数生长期时间等)、基础凋亡率、细胞增殖指数和细胞周期各时相的分布均无明显差异。软琼脂克隆形成试验中转染hOGG1核酶基因的A549-R细胞克隆形成数显著低于未转染的A549细胞，而SOD活性则显著高于未转染细胞。 4、就损伤和修复相比，转染细胞和非转染细胞在修复方面的差异远远大于损伤的差异。对于损伤，四种受试物(K2Cr2O7、H2O2、ADM、60Co-γ射线)仅在个别浓度或个别指标表现出A549-R细胞的敏感性大于A549细胞；在修复方面，无论是修复的时间或/和修复的能力均表现出A549-R细胞的修复远远低于A549细胞。流式细胞术检测结果显示：ADM和60Co-γ射线均可引起细胞G0/G1期阻滞，细胞凋亡增加、细胞增殖指数减慢，并以A549-R细胞更为明显。MTT结果显示：在相同浓度下A549-R细胞存活率明显低于A549细胞。所有这些结果均提示hOGG1核酶的导入可能增强转染细胞对ADM的药物敏感性和60Co-γ射线的放射敏感性。

目录

前言(立题依据及研究背景)

前言参考文献

第一部分 hOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

引言

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第二部分：HOGG1低表达细胞株的建立及鉴定

引言

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第三部分 低表达细胞株的生物学特性鉴定

引言

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第四部分 hOGG1低表达细胞株的初步应用研究

引言

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

(一)重铬酸钾和过氧化氢对hOGGl低表达细胞株的影响

(二)60CO-γ射线对hOGGl低表达细胞株的影响

(三)阿霉素对hOGGl低表达细胞株的影响

四 讨论

五 小结

全文总结

正文参考文献

文献综述 DNA氧化损伤修复基因OGG1研究进展

综述参考文献

附录Ⅰ 主要中英文词汇对照表

附录Ⅱ 在读期间科研成果简介

附录Ⅲ 个人简历

致谢

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