新型高抗草甘膦EPSPS基因的克隆及草甘膦N-乙酰转移酶的活性位点鉴定

摘要

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)(EC2.5.1.19)]是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。有些微生物来源的EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，这一途径是生物产生草甘膦抗性的被动方式；另一方面，最新研究发。现，草甘膦能被草甘膦 N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)乙酰化，乙酰化的草甘膦失去与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，这是宿主生物获得草甘膦耐受的主动方式。 草甘膦的广泛使用及其非选择性的特点，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦转基因作物成为研究热点。但迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有CP4-EPSPS基因，许多本身无抗性或抗性不高的EPSPS基因，通过突变其氨基酸而降低与草甘膦之间亲和性来产生草甘膦抗性的同时，也降低了与PEP之间的亲和性，使酶活性不足，难以应付反应所需；另一方面，利用N-乙酰转移酶的草甘膦耐受机制培育的新抗草甘膦转基因作物还未见问世。如今，改造草甘膦N-乙酰转移酶，提高其抗性，培育新基因型抗草甘膦转基因作物及结合高抗EPSPS培育双价抗草甘膦转基因作物成为新的研究方向。我国作为草甘膦生产和出口的大国，目前尚没有具有自主知识产权的、适用于转基因抗草甘膦作物的EPSPS基因，在国际竞争中处于不利地位；而对草甘膦N-乙酰转移酶的研究还处于起步阶段。因此，寻找具自主知识产权的高抗草甘膦EPSPS新基因、开展对草甘膦N-乙酰转移酶活性位点的研究，对寻找抗草甘膦新基因中的专利保护位点以及改造、利用新基因培育新型抗草甘膦转基因作物均具有积极意义。 本论文就当前我国抗除草剂作物基因工程中存在的“草甘膦抗性功能基因缺乏”这一主要问题，针对抗草甘膦的被动和主动机制，开展了对EPSPS和GAT的研究。充分利用我国极端污染环境微生物基因资源的生物多样性，采用现代分子生物学技术构建了草甘膦极端污染土壤的宏基因组文库，通过对大肠杆菌aroA突变株的功能互补对文库进行了筛选；并通过生物信息学技术预测了草甘膦N-乙酰转移酶的保守区，对部分活性位点作了分析鉴定，主要的研究成果如下： 1、构建了大肠杆菌aroA基因的插入突变株 对突变株进行功能互补、通过突变株某一性状的恢复来筛选基因是一种直接、巧妙、高效的方法，现已有诸多利用大肠杆菌突变株的功能互补来获得目的克隆的报道。大肠杆菌的EPSPS由aroA基因编码，当aroA基因突变后，大肠杆菌的莽草酸途径被阻断，不能合成大肠杆菌生存所必需的芳香族氨基酸，使大肠杆菌丧失了在限制性培养基中生长的能力。但当向该突变株中转入EPSPS的编码基因后，它能恢复在限制性培养基中的生长能力。因此，大肠杆菌aroA基因突变株结合限制性培养筛选基是EPSPS基因的高效筛选平台，构建大肠杆菌aroA突变株是克隆草甘膦抗性EPSPS基因的一个重要环节。 传统构建大肠杆菌突变株的方法是依赖大肠杆菌自身Rec A和Rec BCD组成的Rec A重组系统，但此系统有较大的不足之处：Rec BCD具有核酸外切酶V活性，会降解线性DNA分子，所以必须构建环形的具有靶位点的打靶质粒才能不被分解；另外，Rec A重组几率很低，很难获得所需的重组子。 本研究首先构建了中间带有卡那霉素抗性筛选标记、两侧片段与aroA基因同源的线性DNA片段AK(AK两侧与aroa的同源部分长度>500bp)及中间带有氯霉素筛选标记、两侧片段与aroA基因同源的线性DNA片段AC(两侧与aroA的同源臂为40bp)，将它们电击转化入含有辅助质粒pKD46、能表达λ噬菌体Red重组系统的大肠杆菌BW25113中。Red重组系统能实现直接利用线性DNA转化来构建大肠杆菌突变株，并且重组效率高。在该系统的介导下，带长同源臂的DNA片段AK与大肠杆菌基因组发生同源双交换，获得了卡那霉素抗性基因插入的aroA基因突变株AKM4188。AKM4188不能在限制性培养基中生长。但当转入自身EPSPS或HGT7 EPSPS的编码基因后，它能恢复在限制性培养基中的生长能力。AKM4188的构建，为新草甘膦抗性EPSPS基因筛选奠定了重要基础。 2、建立草甘膦极端污染土壤的宏基因组文库及高抗草甘膦EPSPS新基因的克隆 土壤微生物中蕴藏着巨大的基因资源，但利用现在的培养技术可培养的微生物只占其总量的1％以下，因此人们对这一资源宝库的了解和利用还十分有限。随着分子生物学技术的发展和微生物学研究手段的进步，宏基因组(metagenomics)技术应运而生。宏基因组技术能直接从环境样品中提取总DNA，构建总DNA文库，通过功能分析或序列分析来筛选目的基因。这一技术为我们研究目前尚不可培养的微生物、开发新的基因资源提供了可能。据报道，通过功能筛选宏基因组的方法已经获得了许多新的和已知抗生素的抗性基因，脂酶、几丁质酶、膜蛋白及代谢4-羟基丁酸的酶编码基因，以及一些编码生物素合成途径的酶基因等。在医药、农业和工业应用上潜力巨大。 本研究从草甘膦极端污染土壤中直接分离、提取细菌总DNA，经.9au3A I酶切成2至6kb的片段后，将其连入经BamH I酶切、并去磷酸化的pACYC184质粒。所得的重组质粒转化AKM4188后获得约5，000个克隆的土壤宏基因组文库。将这些克隆在含有草甘膦的限制性培养基上筛选，从中分离得到能抗草甘膦近200mM的EPSPS新基因RD aroA。选择部分Class Ⅰ型和Class Ⅱ型EPSP合酶氨基酸序列与本研究所获得的RD EPSPS在http://www.ebi.ac.uk/selvices网上用T-Coffee进行多基因序列比对表明RD EPSPS与Ⅰ型EPSPS氨基酸的identity值低于30％；而与Ⅱ型的EPSPS氨基酸的identity值高于50％，该结果说明RD EPSPS属于Ⅱ型EPSPS。比对结果还显示RD EPSPS也具有与草甘膦抗性相关和维持PEP绑定相关的重要区域。将RD aroA在大肠杆菌中表达、对其表达产物的酶动力学研究表明，RD EPSPS不仅具有高的草甘膦抗性(200mM)，Ki(glyphosate)为121μM，而且具有较高的PEP亲和性[Km(PEP)：34μM]，提示该基因有望成为培育高抗草甘膦转基因作物的基因材料。 3、草甘膦N-乙酰转移酶活性位点的鉴定 草甘膦被植物吸收后会残留在植物中，并在其分生组织中积累，植物的生长发育因此受到影响，从而降低了农作物的产量。草甘膦N-乙酰转移酶的发现为解决这一问题提供了可能。草甘膦N-乙酰转移酶能将草甘膦乙酰化生成乙酰草甘膦而使之解毒、失去除草剂活性。草甘膦乙酰化解毒可以避免草甘膦在植物体内的积累，使得草甘膦在作物的整个生长周期都可应用，不受生长发育阶段的限制，同时也能耐受更高的草甘膦浓度。这一发现揭示了新的草甘膦耐受机制，为培育草甘膦耐受农作物提供了另一可选的模式。 虽然草甘膦N-乙酰转移酶的晶体结构已报道，但其抗性相关的保守区域及活性位点还尚不清楚。揭示该蛋白的活性位点，对在抗草甘膦新基因中寻找新的专利保护位点和高效特异的抑制剂以及改造、利用该基因均具有一定的指导意义。 本研究通过利用Rate4Site这一生物学软件，根据N-乙酰转移酶家族进化和拓扑学的关系，预测了草甘膦N-乙酰转移酶的保守区。从保守区及非保守区各选取3个位点进行定点突变，分别检测了突变体的草甘膦抗性，并将各突变体在大肠杆菌中表达，突变体蛋白纯化后进行了圆二色谱(CD)及荧光光谱检测。以上实验结果证明，在预测保守区的位点P<'134>(MTGAT1)、S<'52>(MTGAT13—2)、I<'53>(MTGAT87)发生突变后，GAT草甘膦的抗性几乎丧失，并且其相应的CD谱线和荧光谱线也较野生型发生了较大变化；而在非保守区的位点突变后，其草甘膦抗性及相应的谱线并没有发生变化。这些实验结果与生物信息学软件预测的结果基本一致。这一结果也提示：P<'134>、S<'52>、I<'53>突变会以不同的机制影响GAT的结构和功能，是GAT的活性位点。

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论文说明:图表目录

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摘要

第一章大肠杆菌aroA基因突变株的构建

引言

1.1实验材料

1.1.1供试菌株及质粒

1.1.2培养基

1.1.3酶及生化试剂

1.1.4主要仪器

1.1.5引物合成与测序

1.2实验方法

1.2.1大肠杆菌基因组的提取(CTAB法)

1.2.2琼脂糖凝胶中DNA片段的回收(参照试剂盒QIAEXⅡ的说明书)

1.2.3质粒提取

1.2.4感受态细胞的制备(氯化钙转化法)及热击转化DNA

1.2.5电击转化感受态细胞制备

1.2.6电击转化

1.2.7线性DNAAK的准备

1.2.8线性DNAAC的准备

1.2.9含有pKD46的E.coliBW25113电转化感受态细胞的制备

1.2.10线性DNA的转化及突变株的筛选

1.2.11突变株的鉴定

1.3结果

1.3.1含抗性盒的线性片段的获得

1.3.2突变株的筛选结果

1.3.3突变株的分子验证

1.3.4突变株的功能验证

1.4讨论

参考文献

第二章草甘膦极端污染土壤高抗EPSPS新基因RDaroA的克隆及其表达产物的酶动力学研究

引言

2.1实验材料

2.1.1土壤样品

2.1.2供试菌株及质粒

2.1.3培养基

2.1.4酶及生化试剂

2.1.5主要仪器

2.1.6酶活检测相关溶液

2.1.7引物合成与测序

2.2实验方法

2.2.1草甘膦污染土壤细菌总DNA提取和纯化

2.2.2宏基因组文库的建立

2.2.3草甘膦抗性重组子的筛选

2.2.4草甘膦抗性新基因RD aroA的草甘膦抗性检测

2.2.5 RD aroA基因大肠杆菌表达载体的构建

2.2.6 RD EPSPS蛋白表达产物SDS-PAGE分析

2.2.7 RD EPSPS蛋白酶粗提

2.2.8 RD EPSPS酶动力学分析

2.3实验结果与分析

2.3.1土壤细菌DNA的提取

2.3.2宏基因组文库的构建及EPSPS基因克隆

2.3.3草甘膦抗性片段的草甘膦耐受实验

2.3.4RDaroA基因表达载达体的构建及表达

2.3.5RDEPSPS粗酶液的提取

2.3.6RDEPSPS酶动力学分析

2.4讨论

2.4.1土壤总DNA提取方案

2.4.2RDEPSPS的谱系及动力学参数分析

参考文献

第三章草甘膦N-Z酰转移酶保守区预测及抗性相关位点分析

引言

3.1实验材料

3.1.1预测所用的生物信息网站及生物学信息软件

3.1.2供试菌株及质粒

3.1.3酶及生化试剂

3.1.4主要仪器

3.1.5引物合成与测序

3.2实验方法

3.2.1gat基因保守区的预测

3.2.2gat基因的定点突变

3.2.3MT-GATS的草甘膦抗性实验

3.2.4MT-GATS蛋白的诱导表达

3.2.5MT-GATS蛋白的纯化

3.2.6MT-GATS纯化蛋白的透析和浓缩

3.2.7MT-GATS纯化蛋白的定量

3.2.8MT-GATS纯化蛋白的圆二色谱检测

3.2.9MT-GATS纯化蛋白的荧光光谱检测

3.3实验结果

3.3.1 gat基因保守区的预测

3.3.2 gat基因的定点突变

3.3.3 MT-GATS的草甘膦抗性实验

3.3.4MT-GATS蛋白的诱导表达

3.3.5 MT-GATS蛋白的纯化

3.3.6 MT-GATS纯化蛋白的圆二色谱检测

3.3.7 MT-GATS纯化蛋白的荧光光谱检测

3.4讨论

3.4.1 GAT保守位点与草甘膦抗性

3.4.2 GAT保守区的空间位置

3.4.3 S52、I53及p134位点与草甘膦抗性相关的可能机制

参考文献

结论

文献综述

致谢

在读期间发表论文、申请专利情况