一氧化氮供体对肿瘤生长转移调控的研究

摘要

研究发现，小分子一氧化氮(NO)在生物体内具有广泛的生理活性，参与诸多生理功能和病理生理过程。其兼有信号分子和自由基的双重性质。NO与肿瘤生长侵袭的关系也是近年来研究的热点，由于NO的双重特性决定其对于肿瘤的调控具有“两面性”—既存在抑制作用又存在促进作用。本课题通过细胞培养、动物模型等途径应用L-精氨酸(L-Arg)、硝酸甘油(GTN)、氨基胍(AG)等三种调控NO生成的药物，观察对肿瘤细胞生长增殖的影响；应用GTN干预观察肿瘤细胞转移以及相关基因和表达蛋白质谱的改变。进一步探讨了NO调控肿瘤转移的机制，以及一氧化氮供体药物潜在的抗肿瘤转移功效。 一、不同一氧化氮调控药物对肿瘤细胞增殖抑制在LLC肿瘤细胞培养体系中加入不同浓度L-Arg、GTN、AG后观察到，三种药物高浓度均抑制细胞增殖，随浓度降低抑制作用减弱，L-Arg和GTN在低浓度均产生对肿瘤增殖的促进作用。加入L-Arg和AG的细胞培养液中随药物浓度下降NO2-水平逐步升高，加入GTN的细胞培养液中NO2-水平与药物浓度正相关；观察不同药物组合对细胞增殖影响，L-Arg和AG在一定浓度出现拮抗作用，而硝酸甘油和氨基胍基本为协同作用；二、GTN对肿瘤细胞转移相关基因和表达蛋白质谱的调控作用根据前部试验在Hela细胞培养体系中加入较高浓度(40μug/ml)的GTN，形态学观察细胞生长受到抑制，通过基因芯片检测发现血管生成基因和转移相关基因的表达发生明显改变，而且变化趋势以下调较多；应用双向电泳技术观察到多个蛋白质点表达量有不同程度的改变，并出现新的差异表达蛋白点，运用RT-PCR和ELISA方法对基因芯片结果进一步确定，发现GTN干预后MMP-9基因表达和细胞外液蛋白表达水平均有下降，对TIMP-1无明显影响或轻微促进作用，二者比值明显改变；三、高浓度GTN对肿瘤转移具有抑制作用并与调控MMP-9/TIMP-1表达有关通过小鼠LLC肿瘤转移模型观察到1.6g/L硝酸甘油溶液灌胃10d，肺转移瘤抑制率为52％，较对照组明显降低，同时明显抑制MMP-9表达，对TIMP-1无明显影响，改变MMP-9/TIMP-1的动态平衡，并发现在该浓度和其它较低浓度对动物身体未产生明显不利影响，各脏器和生理功能无明显改变。 综上所述，本课题研究结果显示，一氧化氮能够调控肿瘤细胞增殖和转移，高浓度一氧化氮主要通过下调基因表达和改变蛋白质表达水平来抑制肿瘤转移，硝酸甘油作为一氧化氮供体具有潜在抗肿瘤转移的临床功效，而下调MMP-9/TIMP-1比值水平可能是其作用机制之一。

目录

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英文缩写词表

前言

第一章一氧化氮产生的调控及对肿瘤细胞增殖影响

1材料

2方法

2.1 LLC细胞的培养

2.2 MTT方法检测LLC细胞增殖活性

2.3 LLC细胞培养液亚硝酸盐含量的测定

2.4统计学处理

3结果

3.1 LLC细胞形态学变化

3.2药物对LLC细胞的增殖影响

3.3 LLC细胞培养液中亚硝酸盐含量的变化

4讨论

第二章硝酸甘油对肿瘤细胞转移相关基因的调控

1材料

2方法

2.1 Hela细胞的培养

2.2 GTN处理细胞

2.3 RNA提取和探针标记

2.4基因芯片杂交

3结果

3.1 Hela细胞的形态学变化

3.2细胞RNA质量的分析

3.3基因芯片测试结果分析

4讨论

第三章硝酸甘油对肿瘤细胞表达蛋白谱的影响

1材料

2方法

2.1细胞培养

2.2 GTN处理细胞

2.3双向电泳实验

3结果

3.1双向电泳图谱分析

3.2差异蛋白点分析

4讨论

第四章硝酸甘油对肿瘤细胞MMP-9/TIMP-1表达的调控

1材料

2方法

2.1 RT-PCR方法检测MMP-9/TIMP-1基因表达

2.2细胞培养液MMP-9/TIMP-1蛋白含量测定

2.3统计学处理

3结果

3.1 MMP-9/TIMP-1基因表达及GTN的调控作用

3.2 MMP-9/TIMP-1蛋白表达及GTN的调控作用

4讨论

第五章硝酸甘油对Lewis肺癌小鼠MMP-9/TIMP-1表达以及转移抑制和生理机能影响的研究

1材料

2方法

2.1动物模型制备

2.2分组及干预方案

2.3测量观察指标

2.4肿瘤组织MMP-9/TIMP-1免疫组化分析

2.5小鼠重要脏器病理分析

2.6统计学处理

3结果

3.1实验动物数量分析

3.2 GTN对小鼠LLC肺转移的抑制作用

3.3小鼠血液主要生化指标和硝酸盐含量分析

3.4小鼠重要脏器质量分析

3.5原位瘤组织MMP-9/TIMP-1免疫组化分析

3.6肿瘤组织HE染色分析

3.7小鼠重要脏器病理分析

4讨论

总结

参考文献

一氧化氮与MMP-9基因和肿瘤转移关系的研究进展(综述)

攻读学位期间发表文章情况

致谢

发表论文一：应用基因芯片技术观察硝酸甘油对肿瘤细胞血管生成相关因表达的调控

发表论文二：一氧化氮供体对Lewis肺癌小鼠肿瘤转移及生理功能的影响

发表论文三：纳米化技术对玉米活性物质抗氧化水平的增效研究

发表论文四：不同药物调控一氧化氮产生对Lewis肺癌细胞增殖的影响

发表论文五：纳米化技术对抗疲劳药物的增效研究

发表论文六：双向电泳分析比较GTN调控HELA细胞的蛋白表达差异

发表论文七：汉族人胆固醇酯转运蛋白的基因TapIB、MspI多态性与冠心病的关系研究

发表论文八：基因芯片研究GTN调控HELA细胞的血管生成相关基因的表达

发表论文九：21三体综合征和视经管缺陷产前筛查

发表论文十：疾病防治与抗氧化剂应用

发表论文十一：硝酸甘油对Lewis肺癌转移以及血生化和血NO3-含量影响的研究