Caveolin-1调节癌细胞线粒体功能并介导能量代谢转换的分子机制研究

摘要

癌症独特的能量代谢方式是其恶性表型的标志性特征之一，发展针对癌症能量代谢的治疗手段将是实现癌症有效治疗的新方向。有多篇报道指出细胞小窝结构的成分蛋白：小窝蛋白1（caveolin-1, Cav-1）与细胞能量代谢密切相关，同时小窝结构也是细胞与外界环境进行信息交换的桥梁，其运动性是其功能发挥的基础。本文通过研究Cav-1/小窝结构内吞及运动性信号途径，以及Cav-1和线粒体之间的相互作用，揭示Cav-1在细胞能量代谢中所扮演的角色，以及Cav-1运动性的关键作用，取得的主要研究成果如下：
　　1. RalA调节Cav-1/小窝依赖的内吞过程：（a）通过考察牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin）诱导的内吞过程中RalA活化状态的变化，证明内吞过程可触发RalA活化。（b）通过检测RalA持续活化突变体和显性负突变体对内吞以及RalA，Cav-1结合水平的影响，说明内吞过程的实现以及RalA与Cav-1的结合都需要RalA活化。（c）利用siRNA的方法抑制RalA的表达，同时转染质粒恢复其表达，对比抑制前后以及恢复表达后内吞水平的变化，证明RalA是Cav-1/小窝内吞的重要调节分子。
　　2. RalA通过活化下游效应分子PLD（Phospholipase D）调节Cav-1/小窝依赖的内吞：（a）通过研究PLD非特异性抑制剂对内吞的影响，证实PLD活化对内吞的促进作用。（b）采用PLD1和PLD2特异性抑制剂确定只有PLD2是内吞的调节分子。（c）PLD2抑制剂和突变体对Cav-1-RFP运动性的抑制再次证实PLD2在此过程中的重要作用。（d）通过PA感应器GFP-PASS（phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity）观察内吞过程中PLD2下游产物PA（phosphatidic acid）在小窝生成并由此促进Cav-1/小窝依赖的内吞。
　　3. Cav-1抑制引起线粒体形态学的改变：（a）采用siRNA的手段抑制Cav-1的表达，同时观察线粒体形态，发现线粒体呈现片段化和增长的双重改变。（b）利用PA-GFP（photoactive-GFP）在线粒体的扩散程度量化线粒体的基质融合程度，此结果亦可代表线粒体的动态水平。对比Cav-1抑制前后，发现抑制后细胞的线粒体有更高的动态水平。（c）通过FRAP（fluorescence recovery after photobleaching）方法测试基质蛋白的运动速率，进一步强化Cav-1抑制提升线粒体动态水平的结论。
　　4. Cav-1通过抑制Mfn2和Drp1的线粒体定位改变线粒体动态：（a）线粒体组分分离发现抑制Cav-1，Mfn2和Drp1在线粒体的表达量增加。（b）通过免疫共沉淀和FRET（fluorescence resonance energy transfer）的方法证实Cav-1分别与Mfn2和Drp1二者结合。（c）免疫荧光染色同样检测到抑制Cav-1时Drp1在线粒体的定位增加。（d）引入ER和线粒体的人工链接分子OMM-ER-mRFP加强ER和线粒体交互，发现Mfn2在Cav-1抑制的情况下发生ER回流，说明Cav-1可能通过调节ER和线粒体交互来调整Mfn2在二者的表达水平。
　　5. Cav-1的抑制是线粒体自噬的诱因：（a）对比Cav-1抑制前后线粒体比量的变化发现Cav-1抑制导致线粒体比量减少。（b）通过对比细胞自噬标志分子表达量，发现Cav-1抑制细胞的自噬水平升高。（c）引入mt-Keima检测线粒体自噬，证实Cav-1的低表达可诱导线粒体自噬的发生。
　　6. RalA通过Cav-1影响线粒体功能和细胞能量代谢：（a）采用siRNA的手段实现RalA和Cav-1的单独和共同抑制。（b）检测MMP，ATP，H2O2和糖酵解产物L-lactate的生成，发现RalA和Cav-1抑制的细胞中出现MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加，并且RalA和Cav-1共同抑制时与单独抑制Cav-1结果无异，证明RalA的作用是借Cav-1发挥的。
　　总之，本论文通过对Cav-1/小窝内吞途径的分析确立了RalA在此过程中的重要调节作用，并证实该作用是通过其下游效应分子PLD催化PA在小窝生成而实现的。通过研究Cav-1与线粒体的关系，发现Cav-1抑制Mfn2和Drp1的线粒体表达进而调节线粒体动态水平和线粒体自噬。最后将RalA和Cav-1联系起来，说明Cav-1的表达水平和运动性均能对线粒体功能和细胞能量代谢带来重大影响。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 Cav-1的结构和功能

1.2 Cav-1与肿瘤的关系

1.3 RalA与Cav-1之间的相互作用

1.4 本论文的研究意义和内容

第二章 RalA调控小窝的内吞及运动性

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5讨论

2.6本章小结

第三章 Cav-1调节线粒体动态和线粒体自噬

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5讨论

3.6本章小结

第四章 RalA通过Cav-1调节线粒体功能和细胞能量代谢

4.1 引言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4实验结果

4.5讨论

4.6本章小结

第五章 全文结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的成果