丹参酮ⅡA对宫颈癌细胞PNI相关E6、E6TP1和RET蛋白表达作用的研究

摘要

目的：
　　宫颈癌（cervical carcinoma）的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位，是一个威胁女性生命健康的严重问题。研究发现神经周浸润(Perineural invasion，PNI)存在于包括宫颈癌在内的许多恶性肿瘤之中，且被认为是肿瘤的一个不良预后因素，但目前对于PNI的发生机制尚未完全清楚。现有研究表明神经胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor，GDNF)在PNI过程中起重要作用，其通过激活受体RET产生生物学效应。E6蛋白与宫颈癌的发生发展密切相关，E6TP1是能与E6相互作用的抑癌蛋白，E6蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解E6TP1，活化Rap1通路，促进宫颈癌的发生发展。Rap1GAP也是一种抑癌蛋白，不但能灭活Rap1的蛋白，还能与RET结合，抑制RET内化转运过程，使RET表达降低，抑制其下游信号通路的活化，负性调控GDNF诱导的神经突的生长，其表达还与HPV感染有相关性，而E6TP1与Rap1GAP同属于RapGAPs家族成员，因此，设想在宫颈癌中，E6、E6TP1、RET之间是否存在一定联系，导致宫颈癌PNI的发生发展。
　　丹参酮ⅡA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）是丹参中最丰富的有效成分之一，具有抗炎，抗氧化和细胞毒活性，研究发现丹参酮ⅡA能够抑制宫颈癌增殖活性；通过下调HPV E6、E7癌基因的表达，抑制宫颈癌细胞的生长。
　　本实验通过研究丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa和C33A细胞存活率及迁移的影响，并检测宫颈癌PNI相关E6、E6TP1、RET、P-RET蛋白的表达情况，初步探讨宫颈癌PNI发生发展的相关作用机制以及丹参酮ⅡA对宫颈癌细胞PNI的相关作用。
　　方法：
　　体外培养宫颈癌CaSki、HeLa和C33A细胞，采用结晶紫法测定不同浓度丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞的生长抑制作用；采用western blot检测宫颈癌PNI相关E6、E6TP1、RET、P-RET蛋白的表达；采用细胞划痕实验检测丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa和C33A细胞迁移能力的影响。
　　结果：
　　1、不同浓度丹参酮ⅡA作用宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞72h后，以剂量依赖方式抑制宫颈癌细胞的存活（(P<0.05），其IC50分别为（13.44±0.55）mol/L、（1.55±0.14）mol/L和（14.95±1.57）mol/L。丹参酮ⅡA对HeLa细胞的生长抑制作用较CaSki、C33A细胞显著，差异具有统计学意义（P<0.05），而对CaSki和C33A细胞的生长抑制作用其差异无统计学意义(P>0.05)。
　　2、在CaSki细胞中，不同浓度丹参酮ⅡA作用24h后，与对照组相比，E6蛋白的表达下调，E6TP1蛋白的表达上调，RET和P-RET蛋白的表达均下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；且除了E6TP1蛋白随药物浓度增加其表达无统计学差异（P>0.05）外，E6、RET、P-RET蛋白均随药物浓度的增加其表达逐渐下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。在HeLa细胞中，不同浓度丹参酮ⅡA作用6h后，与对照组相比，E6蛋白的表达下调，E6TP1蛋白的表达上调，RET和P-RET的表达均下调，差异具有统计学意义（P<0.05），且除了E6TP1蛋白随药物浓度增加其表达无统计学差异（P>0.05）外，E6、RET、P-RET蛋白均随药物浓度的增加其表达逐渐下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。丹参酮ⅡA作用C33A细胞后，与对照组相比，E6TP1蛋白的表达下调，RET、P-RET蛋白的表达均下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　3、丹参酮ⅡA能够抑制CaSki、C33A细胞的迁移：丹参酮IIA作用CaSki、C33A细胞48h后的迁移距离明显小于相应对照组的迁移距离，其差异具有统计学意义（P<0.05）；而在12h、24h处的迁移距离与相应对照组的迁移距离相比较其差异无统计学意义（P>0.05）。丹参酮ⅡA对HeLa细胞迁移抑制作用不明显：丹参酮IIA作用HeLa细胞12h、24h、48h后，其实验组的迁移距离与相应对照组的迁移距离相比其差异均无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：
　　丹参酮ⅡA作用HPV阳性细胞株CaSki、HeLa后均能下调E6蛋白的表达，具有一定的抗HPV病毒的作用。
　　丹参酮ⅡA作用HPV16阳性细胞株CaSki后，通过下调E6蛋白的表达，使E6TP1蛋白的表达上调，进而下调RET和P-RET蛋白的表达，抑制了细胞的迁移能力，提示丹参酮ⅡA可能通过调节宫颈癌PNI相关E6、E6TP1、RET蛋白的表达，阻断RET下游信号通路的活化，抑制了宫颈癌PNI的发生发展，为研究宫颈癌PNI的相关机制奠定了一定的实验基础。
　　丹参酮ⅡA作用HPV阴性细胞株C33A后，虽然下调了E6TP1蛋白的表达，但也下调了RET和P-RET蛋白的表达，抑制了细胞的迁移，提示丹参酮ⅡA可能通过调节其他宫颈癌PNI相关蛋白的表达或通过直接下调RET和P-RET蛋白的表达，阻断RET下游信号通路的激活，抑制宫颈癌PNI的发生发展。

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英文缩略词对照表

引言

1、实验材料与仪器

1.1实验细胞株

1.2主要药物及试剂

1.3主要仪器及耗材

1.4实验常用试剂配制

2、方法及技术路线

2.1实验流程

2.2 细胞复苏、传代、培养、冻存步骤

2.3 结晶紫法测不同浓度丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞的生长抑制作用

2.4免疫蛋白印迹（Western Blot）法检测丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa和C33A细胞中E6、E6TP1、RET蛋白的影响

2.5细胞划痕实验测丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞的迁移影响

2.6统计学分析

3、结果

3.1结晶紫法测不同浓度丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞的生长抑制作用

3.2免疫蛋白印迹（Western Blot）法检测丹参酮ⅡA对宫颈癌CaSki、HeLa、C33A细胞中E6、E6TP1、RET、P-RET蛋白的影响

3.3丹参酮ⅡA作用宫颈癌CaSki、HeLa和C33A细胞后对细胞迁移的影响

4、讨论

结论

问题与展望

致谢

参考文献

综述: 丹参酮ⅡA抗肿瘤机制研究进展

附录一：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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