云芝Cov-1菌株原生质体诱变育种、发酵工艺条件优化及其复方制剂——芝参正肝提取工艺的研究

摘要

云芝［Corilus versicolor(L.er.Fr.)Qu’ei.]是一种世界性分布的药用真菌。云芝多糖肽具有明显的抗肿瘤、改善免疫功能、降血压、抗炎等功效。中医认为云芝具有扶正固本、补益精气的作用。本论文对云芝Cov-1菌株的选育、发酵条件的优化等方面进行了系统研究，同时对云芝糖肽的复方制剂-芝参正肝胶囊的提取工艺进行了研究。 1.研究了酶种类、酶浓度、酶解温度和时间、渗透压稳定剂、pH值及菌龄等因素对云芝原生质体制备以及不同再生培养基对云芝原生质体再生的影响。结果表明，菌龄3 d的云芝菌丝体用3％溶壁酶，以pH 5.5、0.4 mol/L的KCI为稳定剂，30℃酶解5 h获得的原生质体产量最高；用RM1再生培养基培养，原生质体再生率最高。 2.采用云芝原生质体紫外诱变方法，从出发菌株筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的云芝诱变菌株——YBUV113，该菌株在综合PDA斜面上生长速度较快，长势旺盛。在液体培养基中发酵生长迅速，菌丝湿重、干重和多糖产量均与出发菌株相当。 3.碳、氮源是影响液体培养云芝菌丝体生长的重要因素。其中，玉米粉是其适合碳源，黄豆饼粉为其适合氮源。实验确定了云芝深层培养的较适合的培养基组成为：玉米粉2％，黄豆饼粉2％，KH2PO40.3％，K2HP040.3％。最佳摇瓶培养条件为：培养基起始pH5.5，接种量20％，摇床转速180r/min，培养3天。在上述条件下，每升发酵液可获得干菌丝体34.5g/L。糖含量53.74％，蛋白含量18.36％。 4.芝参正肝是云芝糖肽的复方制剂，由云芝糖肽、丹参、三七、赤芍、葛根、银杏叶6味中药组成的现代中药复方制剂。本文对芝参正肝提取纯化工艺进行了研究，通过提取方法的比较和正交试验确定了芝参正肝提取方法及其优化工艺条件。结果，渗漉提取最佳工艺条件为：药材粉碎成粗粉，用14倍药材重量的70％亿醇渗漉，渗漉速度为1mL/min；大孔树脂纯化最佳工艺条件为：上柱提取液浓度为200mg/mL，上柱流速3Bv/h，洗脱时采用60％乙醇，体积为3Bv，洗脱流速为3Bv/h。由最佳工艺提取的芝参正肝原料中有效成分丹酚酸B、芍药苷、人参皂苷Rgl和银杏总黄酮之和为45％。

目录

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声明

第一章绪论

1.1立题背景与依据

1.1.1引人注目的肿瘤新疗法——免疫疗法

1.1.2新型抗肿瘤免疫调节剂——真菌多糖

1.1.3抗癌真菌抗癌中的佼校者——云芝及其提取物云芝糖肽

1.2立题意义

第二章云芝原生质制备与再生条件的研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料、试剂与仪器

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1原生质体的释放方式

2.3.2不同酶种类对原生质体的影响

2.3.3菌龄对原生质体的影响

2.3.4渗透压稳定剂对原生质体的影响

2.3.5不同pH值对原生质体的影响

2.3.6酶浓度及酶解时间对原生质体的影响

2.3.7再生培养基对原生质体的影响

2.4 结论

第三章云芝原生质体诱变选育高产菌株

3.引言

3.2材料和方法

3.2.1材料、试剂与仪器

3.2.2.培养方法

3.3云芝原生质体紫外诱变

3.3.1致死率的测定

3.3.2原生质体紫外诱变

3.4诱变菌株的筛选

3.4.1初筛

3.4.2复筛

3.5结果与讨论

3.5.1诱变时间与致死率的关系

3.5.2变异株的筛选

第四章云芝Cov-1菌株的营养条件优化和发酵工艺条件探讨

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1材料、试剂与仪器

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1碳源对云芝菌丝体生长的影响

4.3.2氮源对云芝菌丝体生长的影响

4.3.3不同接种量对菌丝体产的影响

4.3.4培养基起始pH值对菌丝体产量的影响

4.3.5枸杞子对云芝菌丝体生长的影响

4.3.6植物油添加量对云芝菌丝体产量的影响

4.4本章小节

第五章云芝糖肽的复方制剂——芝参正肝的提取工艺研究

5.1引言

5.2材料、试剂与仪器

5.2.1材料

5.2.2试剂

5.2.3主要仪器

5.3实验方法

5.3.1指标成分的HPLC检测方法

5.3.2提取方法优选

5.3.3渗漉提取工艺优化

5.3.5大孔吸附树脂预处理

5.3.4大孔树脂静态吸附、解吸

5.3.6大孔树脂动态吸附、解吸

5.3.7大孔树脂纯化工艺条件的优化

5.3.8pH对大孔树脂纯化工艺的影响

5.3.9温度对提取物有效成分的影响

5.3.10芝参正肝提取纯化工艺的验证

5.4实验结果和讨论

5.4.1提取方法优选结果

5.4.2渗漉提取工艺优化

5.4.3静态吸附、解吸初步优选树脂型号

5.4.4动态吸附、解吸优选树脂型号

5.4.5大孔树脂纯化工艺条件的优化

5.4.6 pH对大孔树脂纯化工艺的影响

5.4.7温度对提取物有效成分的影响

5.4.8芝参正肝提取纯化工艺的验证

5.5结论

致谢

参考文献