拟南芥转录因子MS188调控孢粉素合成基因表达的研究

摘要

花粉壁能够保护花粉粒不受外界环境破坏，并帮助促进花粉与柱头识别和水合以完成受精过程。成熟花粉壁分为花粉外壁和花粉内壁，花粉外壁又可分为外壁外层和外壁内层。模式植物拟南芥花粉的外壁外层是由孢粉素构成的 T字形结构和油脂类为主要成分的含油层组成。孢粉素是由多种化合物聚合形成的复合体，其成分复杂而又性质坚韧，对极端环境有极强的抗性。目前研究推测孢粉素的主要成分是长链脂类衍生物和芳香族化合物。近年来通过分子遗传学研究鉴定出几个参与孢粉素成分生物合成的基因，酯酰辅酶A合成酶ACOS5、细胞色素P450羟化酶家族成员CYP703A2与CYP704B1、查尔酮合成酶家族成员PKSA与PKSB、多聚α-吡喃酮还原酶TKPR1/2以及酯酰辅酶A还原酶MS2均参与了孢粉素成分的合成，并通过生化实验推测这些基因参与形成了一条孢粉素前体成分合成的路径。然而关于这些基因如何受到精确调控从而发挥各自生物学功能的研究，目前仅有少量且片面的研究。拟南芥花药绒毡层细胞为花粉壁的发育提供了原料，目前研究认为孢粉素前体成分是在绒毡层细胞内由上述基因编码的功能酶参与合成并转运至小孢子表面沉积形成花粉外壁外层结构。我们实验室发现一条存在于绒毡层细胞内的遗传调控通路DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1。MS188是MYB超级转录因子家族成员，ms188突变体花粉外壁外层T字形结构明显缺失，而外壁内层正常存在，暗示MS188可能参与调控孢粉素的生物合成。已报道bHLH家族转录因子AMS能够在体内结合PKSB和TKPR1的启动子，MS188能够与AMS相互作用共同调控并激活CYP703A2的表达。 在本文中，我们首先通过构建孢粉素合成基因融合 GFP标签序列的转基因植株，观察孢粉素合成功能酶的蛋白定位，发现孢粉素合成酶早期定位于绒毡层细胞，并随花药发育进入药室腔中，暗示孢粉素成分可能在药室腔中继续进行生物合成与加工，最终沉积于小孢子表面。随后我们分析了dyt1、tdf1、ams和ms188突变体植株花序的基因芯片数据，并以定量 PCR实验辅助验证了孢粉素合成基因 PKSA、PKSB、MS2和 CYP703A2处于转录因子 MS188下游，而 ACOS5、CYP704B1、TKPR1和TKPR2处于AMS下游。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）和凝胶迁移阻滞实验（EMSA）分别在体内和体外证明MS188能够结合在PKSA、PKSB、MS2、ACOS5和 TKPR1启动子上，并且 MS188同样能够在体内结合CYP704B1的启动子。进一步通过原生质体转化实验验证MS188能够激活PKSA、PKSB、MS2、TKPR1、ACOS5和 CYP704B1的表达；然而 AMS不能显著激活TKPR1和ACOS5的表达，对CYP704B1的激活能力明显弱于MS188，表明MS188是调控孢粉素合成基因的核心转录因子。AMS与MS188共同存在时，能够更强效激活CYP704B1和TKPR1的表达，结合前文AMS与MS188共同激活CYP703A2表达的结果，我们推测MS188在AMS的辅助下共同调控了孢粉素的生物合成。进一步通过构建 MS188-SRDX显性抑制转基因植株发现，在 AMS的蛋白表达不受影响而MS188功能缺失时，ACOS5、CYP704B1和TKPR1/2的表达明显下调。在 ams突变体中，当 AMS功能缺失时，MS188的正常表达能够显著恢复PKSA、PKSB、ACOS5、CYP704B1和TKPR2的表达，而MS2的表达则与CYP703A2相同，仅得到部分恢复。这些结果暗示在绒毡层中还存在其他MYB与bHLH家族转录因子参与 MS188和 AMS对孢粉素合成基因的调控。我们通过酵母双杂交实验进行初步验证，发现bHLH010能够与MS188相互作用，这一结果支持我们的推测。 基于以上实验结果，本文中我们论述了拟南芥花药绒毡层中可能存在以转录因子MS188为核心形成的多元转录因子复合体参与调控孢粉素合成基因表达的机制，以及AMS与MS188可能形成feed forward loop模式快速调控孢粉素合成基因表达，随后孢粉素合成酶大量分泌进入药室腔促进孢粉素的快速生物合成的机制。这些机理的研究帮助我们更深入地理解绒毡层转录因子调控花粉壁形成的生物学过程，以及该过程在植物进化中对于植物完美保护自身花粉进而正常繁衍后代的重要意义。

目录

第1章 前言

1.1 花药形态及其发育过程

1.2 绒毡层发育及其功能

1.3 绒毡层细胞转录调控网络

1.4 花粉壁的发育

1.5 本研究工作意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验方法

第3章 实验结果

3.1 孢粉素合成相关基因位于转录因子AMS和MS188下游

3.2 MS188下游基因PKSA和PKSB融合GFP标签互补植株构建与鉴定

3.3 PKSA-GFP、PKSB-GFP和转录因子AMS-GFP、MS188-GFP在花药中的定位分析

3.4 MS188直接结合PKSA、PKSB和MS2的启动子

3.5 MS188能够激活PKSA、PKSB和MS2的表达

3.6 ACOS5、CYP704B1和TKPR1/2融合GFP标签互补植株构建与鉴定

3.7 CYP704B1-GFP、TKPR1/2-GFP和ACOS5-GFP蛋白定位分析

3.8 ACOS5、CYP704B1和TKPR1/2基因启动子序列分析

3.9 MS188和AMS均能够结合TKPR1、ACOS5和CYP704B1的启动子

3.10 MS188对比AMS能够更强效激活ACOS5、CYP704B1和TKPR1的表达

3.11 MS188融合SRDX抑制子载体转基因植株的构建与表达分析

3.12 ProAMS::MS188GFP标签植株的孢粉素合成基因的表达分析以及花粉壁脂肪酸染色分析

3.13 转录因子bHLH010与MS188相互作用分析

第4章 讨论

4.1 孢粉素合成功能蛋白定位证明孢粉素前体在药室腔中的合成

4.2 转录因子MS188是激活孢粉素合成基因表达的关键因子

4.3 转录因子AMS和MS188相互作用形成feed-forward loop高效调控孢粉素合成基因的表达

参考文献

致谢

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