Cnb1基因的多态性与T2DM相关性的研究及高糖对其基因表达量的影响

摘要

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后的第三大疾病，是世界上普遍危害人类健康的慢性病之一。作为糖尿病的主要类型T2DM（2型糖尿病)，是一种具有明显异质性的多因素、多基因遗传病，其遗传方式和发病机制十分复杂，许多微效基因突变都会增加其发病的机率。为了更好的了解T2DM发病的分子机制，进行了许多遗传学的研究，目的就是找到与T2DM相关的基因突变。目前多采用对候选基因的SNP位点进行相应分析的方法。 胰岛在生长发育及作用过程中，需要不断的进行调节以适应机体内外环境的变化，维持代谢平衡，许多信号转导通路通过调节相应基因的表达，参与这一过程。最近，Heit 等发现钙调神经磷酸酶（CaN）/NFAT信号通路参与调节胰腺β细胞生长发育及分泌活动,而编码钙调神经磷酸酶调节亚基的Cnb1基因起到了重要的作用。特异性敲除胰腺β细胞Cnb1基因的小鼠，出现以β细胞增殖聚集减少和胰腺胰岛素表达降低及低胰岛素血症为特征的年龄依赖行糖尿病。而人为的特异性激活Cnb1基因敲除小鼠的NFATc1蛋白则可以减轻这些缺陷，阻止糖尿病的发生。这些研究表明，Cnb1基因很可能是T2DM的致病候选基因之一。 为研究Cnb1基因的单核甘酸多态性（SNPs）在上海地区人群2型糖尿病患者和正常对照组人群中的基因型频率、等位基因频率分布及其与T2DM的相关性，选取上海地区无亲缘关系的T2DM患者447例及正常对照440例。用稳态模式胰岛素抵抗指数(HOMA-R)及胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)估测外周组织胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能。利用Haploview 软件在Hapmap数据库所显示的Cnb1基因的序列上选择了5个标签SNP位点：rs12329083、rs12465425、rs13029910、rs2861814及rs11692815作为Cnb1基因的代表位点，采用等位基因专一性实时PCR技术，对T2DM患者及正常对照组人群进行相关位点的基因分型，并进行统计学分析，研究这些位点与2型糖尿病的相关性。结果显示： 1、rs13029910(A/C）(1）三种基因型AA、AC、CC的频率分布，及等位基因A、C的频率分布在正常对照组和T2DM组中均无显著差异（P值分别为0.058、0.112）。(2）rs13029910的CC基因型频率在2型糖尿病患者中较对照组显著升高，CC基因型与2型糖尿病相关，经Logistic回归分析，OR值在2型糖尿病患者为4.018。2、rs12329083(A/T)、rs12465425(G/T)、rs2861814(C/T）及rs11692815(A/G)位点的基因型频率、等位基因频率在T2DM组与正常对照组中的分布差异均无统计学意义。由此得出结论，上海地区T2DM患者和正常人Cnb1基因的5个SNP位点基因型频率、等位基因频率的分布特征为认识T2DM的发病机理提供了信息。其中rs13029910基因型CC与T2DM有较强的相关性，Cnb1基因的rs13029910位点可能与上海地区人群2型糖尿病的遗传易感性有关。 同时环境因素也影响着T2DM的发生发展。为观察葡萄糖刺激对Cnb1基因表达量的影响，选取INS-1细胞株及SD大鼠离体胰岛，在5.6mM、11.1mM及16.7mM等不同糖浓度下进行培养，观察Cnb1基因及其下游靶基因Ccnd1、Ccnd2、CDK4mRNA表达量的变化，并探讨机理。结果显示：高糖刺激下Cnb1基因mRNA表达量呈浓度依赖性下降。加入钙调神经磷酸酶抑制剂FK506后Cnb1表达量并没有出现回升，表明CaN自身的负反馈调节并不起主要作用。而加入细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM及钙离子通道阻滞剂维拉帕米后Cnb1表达量出现回升，因此我们推测，这一变化可能是通过刺激胞内Ca2+聚集引起的。同时观察到高糖刺激下细胞Cnb1基因的下游靶基因Ccnd1、Ccnd2、CDK4等的表达量也呈下降趋势，提示葡萄糖通过CaN/NFAT信号通路降低了与β细胞增殖密切相关的基因Ccnd1、Ccnd2及CDK4的表达，从而对β细胞的增殖造成了损伤。