促红细胞生成素对糖尿病视网膜病变中血—视网膜屏障的保护作用机制研究

摘要

背景介绍：
　　缺血性视网膜微血管病变如糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)和早产儿视网膜病(Retinopathy of Prematurity，ROP)是全球主要的致盲眼病。DR是糖尿病最常见的严重并发症，是糖尿病患者致盲的重要原因之一，临床上对DR及其引起的失明尚缺乏有效的治疗措施，对DR的治疗能够帮助患者减少失明，改善生活质量。同时，由于病人群体之大，任何有效的治疗药物都将带来巨大的经济效益。
　　研究方法：
　　本课题首先采用STZ(Streptozocin)诱导的早期DR模型和低氧诱导的视网膜病变(Oxygen-induced Retinopathy, OIR) ROP模型来研究促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)对DR血-视网膜屏障（Blood-Retinal Barrier, BRB）的保护作用;其次，分别利用慢病毒介导的EPO基因治疗和抑制EPO的表达等手段在视网膜中干预DR的病程，同时对组成BRB的微血管进行细胞水平的观察分析;然后，我们利用骨髓移植(Bone Marrow Transplantation，BMT)和玻璃体腔细胞注射等技术研究EPO对早期DR和ROP模型的保护作用，并对EPO的趋化作用进行讨论;最后，通过siRNA干扰技术抑制EPO受体的表达，研究EPO作用于BMP(Bone Marrow derived Progenitor，BMP)的信号通路，并在体内和体外证明EPO的促增殖、迁移、分化和血管形成能力。
　　结果：
　　本研究发现EPO能够保护STZ诱导的早期DR和OIR诱导的ROP/PDR动物模型的BRB、视网膜细胞凋亡和视网膜电生理功能;同时，EPO能够保护这两种动物模型中组成BRB的微血管网络的各个类群细胞;BMP内含有组成BRB所需的内皮细胞、周细胞和小胶质细胞的前体细胞，并且这些细胞受EPO-EPOR&CD131信号通路的招募;在BMP移植联合早期DR和玻璃体腔注射BMP联合ROP动物模型中，EPO能够招募BMP迁移到受损伤BRB中并分化为其组成细胞;而干扰EPO受体则能够显著的抑制EPO对BMP的招募作用;进一步的研究表明EPO能够改善早期DR和ROP模型中的BRB的黏附分子损伤，并且在体外EPO通过Akt-eNOS信号通路促进BMP增殖、迁移、血管生成。
　　结论：
　　EPO作为一种BMP的趋化因子，通过EPO-EPOR&CD131信号通路招募BMP迁移到受损伤的视网膜中并维持微血管的血液动力学稳定性，这提示EPO可能作为治疗视网膜微血管病变的极具临床应用前途的靶向药物。我们首次提出在DR的视网膜组织中与其消除不正常的新生血管，不如重建和稳定已有的和新生的血管的结构和功能。

目录

声明

摘要

符号说明

1．引言

1．1 DR和ROP的背景介绍

1．2 DR中BRB的变化

1．3 骨髓来源祖细胞

1．4 EPO细胞因子治疗概述

1．5 EPO、EPOR和CD131信号通路

2．材料与方法

2．1 实验线路图

2．2 材料

2．2．1 哺乳动物细胞株

2．2．2 大肠杆菌菌株

2．2．3 质粒

2．2．4 抗体(一抗和二抗)

2．2．5 试剂

2．2．6 引物

2．2．7 实验仪器

2．3 方法

2．3．1 实验性糖尿病动物模型的建立

2．3．2 ROP模型的建立

2．3．3 慢病毒载体构建，病毒包装和浓缩

2．3．4 质粒的大量制备

2．3．5 FLIVO原位凋亡检测

2．3．6 视网膜细胞凋亡检测(TUNEL)

2．3．7 视网膜细胞消化和流式分析

2．3．8 视网膜平铺片，全组织免疫组化

2．3．9 FITC-dextran荧光灌注

2．3．10 视网膜冰冻切片免疫荧光染色分析

2．3．11 分离BMP

2．3．12 构建BMT联合DR嵌合体小鼠

2．3．13 玻璃体腔注射病毒和BMP

2．3．14 视网膜电生理检测Ops

2．3．15 MTT细胞增殖分析

2．3．16 BRB渗透性功能检查

2．3．17 BrdU摄入实验

2．3．18 Matrigel血管形成实验

2．3．19 Transwell细胞迁移实验

2．3．20 DAF-FM染色

2．3．21 细胞免疫荧光染色分析(Immunocytochemistry)

2．3．22 RT-PCR

2．3．23 Real time-PC

2．3．24 荧光素酶报告基因实验(Luciferase REPOrter Assay)

2．3．25 细胞总蛋白的制备与定量

2．3．26 免疫印迹分析(Western blotting)

2．3．27 免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation，CoIP)

2．3．28 数据统计

3．实验结果

3．1 EPO对早期DR动物模型和ROP模型的保护作用

3．1．1 EPO对DR的BRB的保护作用

3．1．2 EPO对DR视网膜凋亡的保护作用

3．1．3 EPO对DR小鼠视功能的保护作用

3．1．4 EPO对ROP中BRB的保护作用

3．1．5 EPO对ROP视网膜稠亡的保护作用

3．1．6 EPO对ROP小鼠视功能的保护作用

3．2 组织学分析EPO对DR及ROP模型中BRB相关微血管细胞的保护作用

3．2．1 EPO对早期DR视网膜中BRB组成细胞的保护作用

3．2．2 EPO对ROP小鼠视网膜中BRB组成细胞的保护作用

3．3 EPO促进BMP迁移到受损伤的视网膜并分化为BRB组成细胞

3．3．1 早期DR模型中EPO能够招募BMP并促进其分化

3．3．2 在ROP模型中EPO能够促进BMP迁移和分化

3．4 EPO受体在BMP中的表达谱

3．4．1 DR联合BMT中循环BMP的鉴定

3．4．2 EPO，EPOR和CD131形成复合物，介导EPO信号通路

3．4．3 在BMP中抑制EPO受体的表达对BMP的影响

3．5 EPO招募骨髓细胞亚群与VEGF信号通路的关系

3．6 抑制EPO的受体对EPO招募BMP和治疗早期DR和ROP疾病的影响

3．6．1 抑制EPO的受体对EPO招募BMP到受损伤视网膜中和治疗早期DR的影响

3．6．2 抑制EPO的受体对EPO促进BMP迁移和治疗ROP模型的影响

3．6．3 EPO+／CD131+分选BMP在ROP模型中的分布情况

3．7 EPO治疗早期DR和ROP视网膜中血管相关细胞的细胞黏附分子的变化

3．7．1 EPO治疗早期DR视网膜中血管相关细胞的细胞黏附分子的变化

3．7．2 EPO治疗ROP视网膜中血管相关细脆的细胞黏附分子的变化

3．8 EPO在体外通过Akt-eNOS信号通路促进BMP增殖、迁移、血管生成

3．8．1 EPO在体外促进BMP增殖

3．8．2 EPO在体外促进BMP迁移

3．8．3 EPO在体外激活Akt-eNOS信号通路

3．8．4 EPO在体外促进BMP的血管生成

4．讨论

4．1 EPO对早期DR和ROP保护作用

4．2 EPO与VEGF的关系

4．3 BMP与BRB

4．4 EPO与BMP的关系

4．5 CD131在EPO的非造血功能中的作用

5．结论

参考文献

致谢

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