利用脱细胞猪角膜基质膜片构建组织工程化兔角膜基质

摘要

目的: 探讨氯化钠法及冰冻切片法制备脱细胞猪角膜基质膜片的可行性，并进一步复合兔角膜基质细胞构建组织工程角膜基质，探讨脱细胞角膜基质膜片在兔角膜基质缺损中的修复效果，为角膜基质的组织工程修复治疗提供实验依据。
　　方法: 将去除上皮层和内皮层的全层猪角膜基质瓣采用氯化钠法脱细胞，组织学检测脱细胞效率，冰冻切片法将脱净细胞的厚基质瓣切成20μm厚度的脱细胞角膜基质膜片，紫外线照射灭菌保存。采用组织块法分离培养兔角膜基质细胞，传至第三代作为构建组织工程角膜基质的种子细胞。将培养的兔角膜基质细胞以三明治法接种于脱细胞角膜基质膜片支架，层层叠加6层膜片形成支架-细胞复合物，体外培养2周后组织学检测组织形成状态。构建兔角膜基质缺损模型，将膜片和基质细胞按照三明治法移植至角膜基质缺损部位，共叠加5层膜片，另设单纯缺损不修复组、厚基质移植组(100μm)、单纯膜片无细胞组（5层）为对照组，术后第1月，3月和6月进行大体拍照观察、眼前节光学相干断层扫描、超声角膜测厚、角膜透光度检测、生物力学检测、组织学检查、透射电镜超微结构观察等，评价治疗效果。
　　结果: 氯化钠法能有效脱除猪角膜基质中的角膜基质细胞，同时能良好地维持基质胶原纤维的形态和排列，在脱细胞基质的基础上制作脱细胞基质膜片简单易行。组织块法培养的兔角膜基质细胞体外生长良好，细胞接种至脱细胞猪角膜基质膜片支架材料上增殖良好，扫描电镜检测显示细胞在膜片上贴附生长良好。体外构建组织分层明显，细胞存活但基质分泌少。兔角膜基质移植修复实验中，单纯缺损不修复组角膜菲薄，局部白色瘢痕及新生血管长入;厚基质移植组透明度尚可，瞳孔区可见云翳，随时间的延长云翳略减淡;单纯膜片无细胞组无明显瘢痕，但可见少量膜片皱褶，角膜欠透明，呈斑翳形态;脱细胞基质膜片接种角膜细胞组3个月时可见缝线周围新生血管生成，6个月时逐渐减退，角膜透明。眼前节光学相干断层扫描显示单纯缺损组基质信号不均，有高信号区的疤痕组织;厚膜片组可见移植膜片与原基质间有明显的界限，融合欠佳;单纯膜片组角膜基质层信号欠均匀，可见裂隙状低信号区，表明膜片间粘合欠佳;膜片加细胞组基质信号较均匀，移植膜片间融合良好。厚度检测发现单纯缺损组最薄，其次为单纯脱细胞基质膜片移植组，脱细胞基质移植组和膜片加细胞移植组的厚度均与正常组接近。脱细胞基质膜片加角膜细胞移植组在各波长可见光下的透光率与正常角膜最为接近。与正常对照组相比，单纯缺损组的生物力学检测值均最低，而脱细胞膜片加细胞移植组术后6个月的最大荷载，抗拉强度和弹性模量均与正常组十分接近。组织学检查发现单纯缺损组的角膜厚度显著变薄，虽然厚基质移植组，及单纯基质膜片移植组的厚度有所增加，但未见细胞分布，而膜片加细胞移植组见细胞均匀分布。透射电镜检测中，膜片加细胞移植组的胶原纤维直径与正常组无统计学意义的差异。
　　结论: 氯化钠法加冰冻切片法制作脱细胞猪角膜基质膜片简单易行。脱细胞猪角膜基质膜片用组织块法培养的兔角膜基质细胞在脱细胞猪角膜基质膜片支架上生长良好，采用膜片与接种细胞叠加的方法能使角膜基质细胞较均匀地分布在基质层中，利于新生角膜基质的生成和修复缺损组织。为构建组织工程角膜基质提供新思路。

目录

声明

摘要

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绪论

第一章 脱细胞猪角膜基质膜片的构建

引言

1．1 材料和方法

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要试剂及设备

1．1．3 主要培养液和试剂的配制

1．2．实验方法

1．2．1 脱细胞猪角膜基质的制备

1．2．2 脱细胞猪角膜基质膜片的制备

1．2．3 HE染色

1．2．4 DAPI染色步骤

1．2．5 MASSON染色

1．2．6 扫描电镜检测

1．2．7 透射电镜检测

1．2．8 原代兔角膜基质细胞的分离与培养

1．2．9 兔角膜基质细胞的传代培养

1．2．10 兔角膜基质细胞在脱细胞猪角膜基质膜片支架上的接种及“三明治”复合物的体外构建

1．2．11 DiO荧光标记检测角膜基质细胞在脱细胞基质膜片支架材料上的增殖生长

1．2．12 兔角膜基质细胞在脱细胞基质膜片支架材料上的生长曲线

1．2．13 统计分析

1．3．实验结果

1．3．1 脱细胞猪角膜基质膜片的构建

1．3．2 原代兔角膜基质细胞的培养

1．3．3 兔角膜基质细胞和脱细胞猪角膜基质膜片体外三明治复合物的构建

1．3．4 兔角膜基质细胞在脱细胞基质膜片支架材料上的生长曲线

1．4．讨论

小结

第二章 兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质膜片构建组织工程化角膜基质组织的实验研究

引言

2．1．材料和方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．2．实验方法

2．2．1 脱细胞猪角膜基质的制备

2．2．2 氯化钠法制备脱细胞猪角膜基质

2．2．3 脱细胞猪角膜基质膜片的制备

2．2．4 HE染色

2．2．5 MASSON染色

2．2．6 免疫组化检测兔角膜基质Ⅰ型胶原

2．2．7 透射电镜检测

2．2．8 原代兔角膜基质细胞的分离与培养

2．2．9 兔角膜基质细胞的传代培养

2．2．10 制作兔角膜基质缺损模型并构建组织工程角膜基质

2．2．11 活体和组织学动态观察

2．2．12 眼前节光学相干断层扫描仪检查

2．2．13 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 组织工程角膜基质移植术后不同时间点大体观察

2．3．2 组织工程角膜基质移植术后眼前节OCT扫描检查

2．3．3 组织工程角膜基质移植术后A超检测角膜厚度

2．3．4 各组角膜透光度检查

2．3．5 组织工程角膜基质移植术后生物力学检测

2．3．6 组织工程角膜基质移植术后组织病理学检查

2．4．讨论

小结

全文结论

参考文献

综述 角膜替代物和角膜再生的研究进展

致谢