缺刻缘绿藻ω3等脂肪酸去饱和酶基因的特性及相对转录量的分析

摘要

缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)、共球藻纲(Trebouxiophyceae)。细胞呈球形或卵圆形，常以单细胞或非定形群体形式聚集生长。藻细胞能大量积累以三酰甘油(TAG)形式结合的花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，尤其是在氮饥饿条件下培养，具有潜在的开发利用价值。
　　 根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)ω3脂肪酸去饱和酶氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和BAB78717)的保守区(TMFWALF和HHDIGTH)设计简并引物，以缺刻缘绿藻H4301总RNA为模板，通过反转录PCR和cDNA末端快速克隆技术(RACE)，克隆了缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的cDNA全长序列(GenBank登录号：EU658930)。该基因cDNA序列长2330bp，其中5’-非翻译区长107bp;3'-非翻译区912bp，且具有明显的poly(A)尾巴；开放阅读框1311bp，编码一个436个氨基酸的蛋白质，分子量为49.06kD，等电点7.85。该基因编码的蛋白为膜结合蛋白，含有2个疏水区域和3个保守的组氨酸簇基序；与莱茵衣藻的这个基因具有69％相似性。将该基因的cDNA序列与其DNA序列比对后，发现该基因在其编码区存在6个内含子，剪切位点均符合“GT-AG”规则。
　　 实时荧光定量PCR结果显示，在氮饥饿培养过程中，缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的相对转录量在4h时可能因休克显著提高(P＜0.05)，然后开始下调，12h始显著下降(P＜0.05)，并在20h降到最低(为完全培养基的11.6％)，此后保持在低水平(为完全培养基的23.2％上下)波动(P＜0.01)。脂肪酸组分的气相色谱结果表明，在氮饥饿培养过程中，AA占总脂肪酸的百分含量逐步提高，而作为多不饱和脂肪酸ω3合成途径的产物，如α-亚麻酸和十六碳三烯酸(16:3ω3)的百分含量在40h或96h后都显著降低(P＜0.05)。这些结果表明缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因在氮饥饿过程中的相对低转录量，导致ω3合成途径相关产物百分含量的降低，确保了该藻沿着ω6途径来合成与积累AA以提高其百分含量。另外，十六碳二烯酸(16:2ω6)、亚油酸及AA都可能是该克隆基因所编码ω3脂肪酸去饱和酶的反应底物。
　　 本研究还克隆了与AA合成有关的△12、△6及△5脂肪酸去饱和酶基因，并对它们进行生物信息学分析，发现△12、△6和△5去饱和酶与ω3脂肪酸去饱和酶相似，富含疏水性氨基酸。序列分析发现它们含有非常保守的序列，都是重要的结构和功能域。这些保守区包括两条长的疏水跨膜区及3个富含组氨酸簇的基序。ω3、△12、△6及△5这4个脂肪酸去饱和酶的系统演化结果显示，不同物种同类基因具有很高的同源性，但这4个基因之间的同源性很低，其中ω3与△12以及△6与△5之间的亲缘关系较近。

目录

文摘

英文文摘

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前言

1 缺刻缘绿藻的研究进展

1.1 缺刻缘绿藻的分类地位

1.2 缺刻缘绿藻的脂肪酸研究

2 脂肪酸的分类及生理功能

2.1 脂肪酸的分类

2.2 多不饱和脂肪酸的生理功能

2.3 多不饱和脂肪酸的生物资源

3 脂肪酸去饱和酶

3.1 脂肪酸去饱和酶的共性

3.2 脂肪酸去饱和酶的分类

3.3 脂肪酸去饱和酶的基因

3.4 脂肪酸去饱和酶的活性调控和影响因素

4 真核微藻中的脂肪酸代谢

5 本研究的目的与技术路线

第一章 缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因全长序列克隆及特征

1.1 材料与方法

1.1.1 藻种来源

1.1.2 缺刻缘绿藻的培养和收集

1.1.3 主要试剂

1.1.4 菌种

1.1.5 ω3 FAD基因的cDNA全长序列克隆

1.1.6 ω3 FAD基因特性分析

1.1.7 ω3 FAD基因的DNA全长序列克隆

1.2 结果与讨论

1.2.1 总RNA提取结果

1.2.2 基因组DNA提取结果

1.2.3 缺刻缘绿藻 ω3 FAD基因的cDNA及DNA序列克隆

1.2.4 序列特征分析

1.2.5 ω3 FAD同源序列比较

第二章 氮饥饿过程中缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因相对转录量与脂肪酸组分变化的关系

2.1 材料与方法

2.1.1 藻细胞培养与收集

2.1.2 试剂

2.1.3 氮饥饿过程中 ω3 FAD基因相对转录量的分析

2.1.4 气相色谱分析脂肪酸组成

2.2 结果

2.2.1 ω3 FAD在氮饥饿过程中相对转录量的变化

2.2.2 缺刻缘绿藻脂肪酸组分的确定

2.2.3 缺刻缘绿藻脂肪酸组分的变化

3.2.3 缺氮培养时花生四烯酸占藻体干重的变化

2.3 讨论

第三章 缺刻缘绿藻△12、△6和△5脂肪酸去饱和酶基因cDNA序列克隆及其特性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 缺刻缘绿藻的培养和收集

3.1.2 菌株和载体

3.1.3 总RNA的提取

3.1.4 反转录反应

3.1.5 引物设计

3.1.6 反转录PCR反应体系及反应程序

3.1.7 RACE法扩增基因5'-端和3’-端

3.1.8 △12、△6、△5及ω3 FAD基因的序列分析

3.2 结果与讨论

3.2.1 △12 FAD基因的cDNA的克隆及其特征

3.2.2 △6 FAD基因的cDNA克隆及其特征

3.2.3 △5 FAD基因的cDNA克隆及其特征

3.2.4 △12、△6、△5和ω3 FAD的序列比对及系统进化分析

结论

参考义献

附录一

附录二

致谢