Growth conditions, omega -3 fatty acid concentrations and gene expression of fatty acid desaturases in Portulaca oleracea leaves =Condições de crescimento, concentração de ácidos gordos ómega - 3 e expressão dos genes de desaturases em folhas de Portulaca

摘要

A beldroega (Portulaca oleracea), foi seleccionada como sistema de estudo para este trabalho com base no seu elevado valor nutricional, em particular no conteudo en acidos gordos polinsaturados, e a tolerância demonstrada a seca e salinidade. O trabalho de investigacao aqui desenvolvido pode ser dividido em quatro pontos essenciais: (i) o estudo dos efeitos da salinidade no valor nutricional da beldroega; (ii) isolamento e caracterizacao dos genes de desaturases envolvidos na sintese de acidos gordos polinsaturados; (iii) estudo do efeito de factores ambientais, como temperatura, salinidade e corte, nos niveis de expressao dos genes de desaturases e na accumulacao de acidos gordos polinsaturados; (iv) estabelecimento de linhas de cultura de celulas de P. oleracea para a producao in vitro de acidos gordos polinsaturados e outras substâncias biologicamente activas. Na primeira parte do trabalho avaliamos o efeitos de quatro regimes salinos (0, 60, 120 e 240 mM NaCl) na composicao quimica da fraccao aerea da beldroega. A salinidade afectou o desenvolvimento e o rendimento das culturas de beldroega, apesar de uma reducao significativa da fraccao aerea da beldroega ser apenas visivel no regime salino mais elevado. A composicao nutritional da beldroega foi negativamente afectada pela exposicao aos tratamentos, com uma reducao do potencial nutricional da cultura. Porem, a composicao nutricional da cultura exposta a 60 mM NaCl foi similar a cultura control com um teor em lipidos totais mais elevado. As culturas de beldroega possuiam um elevado teor em minerais, com quantidades particularmente elevadas de magnesio e potassio. Quando expostas a regimes salinos elevados, os niveis de potassio e calcio diminuiram e os niveis de sodio e magnesio aumentaram. Este desiquilibrio ionico deu origem a elevados indices de Na/K, Mg/K, Na/Ca e Mg/Ca, o que resultou na reducao de rendimento nas culturas expostas ao regime salino mais severo. De acordo com estes resultados podemos afirmar que a beldroega e uma excelente candidata a cultura em areas de salinidade moderada (? 60 mM) em que a introsao de agua salgada ou a qualidade de agua de irrigacao constituem um problema para o estabelecimento de outras culturas mais sensiveis. Uma vez que uma das caracteristicas nutricinais mais relevante da beldroega e o seu elevado conteudo em acidos gordos polinsaturados, a segunda parte deste trabalho incidiu no estudo da biosintese de acidos gordos polinsaturados, particularmente no isolamento e caracterizacao dos genes que codificam para desaturases. Foram isolados tres genes completos de omega-6 dessaturases, aqui designados por PoleFAD2-1, PoleFAD2-2 and PoleFAD6, e dois genes completos de omega-3 desaturases, aqui designados por PoleFAD7 e PoleFAD8. Um clone parcial de uma potencial omega-3 desaturase microssomal, aqui designado por PoleFAD3-A foi tambem isolado. A sequencia polipeptidica dos genes isolados apresentou elevada homologia com sequencias ja publicadas de outras especies vegetais (GeneBank ). Uma analise mais promenorizada das sequencias polipeptidicas revelou a presenca de oito histidinas agrupadas em tres motivos conservados na familia das desaturases, essenciais para o estabelecimento do centro catalitico da enzima. A presenca de um peptido sinal na extremidade azotada da cadeia, envolvido no transporte para o plastidio, nos clones PoleFAD6, PoleFAD7 e PoleFAD8, indica uma elevada probabilidade destas enzimas estarem localizadas nas membranas dos cloroplastros. Nas duas isoformas do gene FAD2 foi identificada uma sequencia rica em amino-acidos aromaticos (- YGNKS/ -YNNTL) na extremidade carbonada da cadeia polipeptidica, que tem sido referenciada como peptido sinal no transporte para o reticulo endoplasmatico. A previsao de tres a quarto dominios transmembranares nas sequencias polipeptidas sugere que estas desaturases sao transmembranares. Neste trabalho tambem foi incluida a expressao de dois dos genes plastidiais isolados, PoleFAD6 e PoleFAD7 em Saccharomyces cerevisiae, para a caracterizacao funcional das desaturases. Infelizmente, nao fomos capazes de concluir este estudo com sucesso, uma vez que nao foi detectada qualquer actividade dos clones nas condicoes testadas. Porem foi possivel verificar, atraves de ensaios de fluorescencia, que ambas as enzimas foram sintetizadas e accumuladas no organello alvo da celula: as membranas celulares. Temperatura, pH e suplementacao do meio com ferro aparentemente nao afectaram os niveis de expressao das enzymas, apesar de se ter detectado uma fraca actividade da omega-6 desaturase (PoleFAD6) a baixos valores de pH (4-5), identificada pela presenca do produto de desaturacao, acido linoleico, no cromatograma (GC). Aparentemente, as enzimas estao a ser sintetizadas pela levedura e sao acumuladas no organelo alvo, mas nao numa forma funcional. E possivel que erros de traducao ou na formacao do centro catalitico estejam na origem da producao de uma forma nao activa da enzima. Estudos anteriores demonstraram que factores ambientais, como a salinidade, afectam o teor em acidos gordos polinsaturados nas culturas de beldroega, pelo que decidimos verificar o efeito da salinidade, corte e temperaturas baixas nos niveis de expressao dos genes das desaturases nesta cultura. Diferencas nos padroes de expressao destes genes foram detectadas para os diferentes stresses impostos, o que sugere que estes genes possam ter diferentes mecanismos de regulacao a nivel transcriptional ou pos-transcripcional. A exposicao das culturas a temperaturas baixas (5 ºC) afectou os niveis de transcricao dos genes microsomais, PoleFAD2-2 e PoleFAD3, mas nao afectou de uma forma significativa os genes cloroplastidiais, com excepcao do PoleFAD8, em que um aumento significativo na expressao foi detectado em resposta as baixas temperaturas. Um acrescimo paralelo nos niveis de acido linoleico(LA) e acido linolenico(ALA) tambem foi detectado nas culturas expostas as baixas temperaturas. A aplicacao de dois cortes longitudinais em folhas de beldroega originou um acrescimo dos niveis de expressao dos genes plastidiais, PoleFAd6, PoleFAD7 e PoleFAD8, acompanhado de um aumento da accumulacao dos respectivos produtos de desaturacao LA e ALA. De um modo geral, a exposicao das culturas a diferentes regimes salinos, induziu um decrescimo nos niveis de transcricao das desaturases, com excepcao do gene FAD8, que apresentou um aumento significativo nos niveis de expressao com a exposicao das culturas a um nivel de salinidade moderado (60 mM NaCl). Aparentemente factores ambientais tais como baixas temperaturas e salinidade tem um papel nos mecanismos de regulacao da transcricao do gene FAD8, ilustrado neste estudo pelo acrescimo significativo dos niveis de expressao em todos os tratamentos aplicados. A ultima parte deste trabalho consistiu no desenvolvimento de linhas de cultura de celulas a partir de explantes de P. oleracea, para a producao in vitro de acidos gordos polinsaturados e/ou outros compostos biologicamente activos. O processo completo de producao de calli a partir da semente levou cerca de 6 -8 semanas. Tres estruturas principais foram obtidas a partir de explantes de beldroega cultivados em meio solido com diferentes proporcoes de fitohormonas (NAA/BAP): calli friaveis brancos (nao fotossinteticos) / verdes (fotosinteticos) (WFC/ GFC), calli compacto verde com forma semelhante a um embriao (GCEC) e eflorescencias de folhas vermelhas (RLE). Uma vez que algumas desaturases estam localizadas nas membranas dos cloroplastros, decidimos utilizar os calli fotosinteticos para estes estudos. Em cultura liquida, os calli friaveis originam uma estrutura circular parcialmente differenciada que pode ser utilizada para a producao in vitro de PUFAs. Quantidades minimas de 3 mg LA/g tecido fresco e de 1 mg ALA/g fresco foram produzidas pelo sistema actual. Devido ao elevado indice de crescimento, com elevada producao de biomassa e o conteudo em PUFAs, estas estruturas estao a ser avaliadas como potenciais fontes vegetais de PUFAs. Os resultados deste estudo originaram uma patente que esta neste momento sob avaliacao. Existe algum interesse na comercializacao deste produto como suplemento nutricional para peixes e gado, com o objectivo de aumentar o conteudo em acidos gordos polinsaturados no musculo e produtos derivados animais.