卵形鲳鲹病毒性神经坏死病及其LAMP快速检测方法研究

摘要

2008年春季，广东湛江一些网箱养殖的卵形鲳鲹Trachinotus ovatus幼鱼发生大规模死亡，每个网箱每天死亡数十至上百尾鱼，累积死亡率超过90％。患病鱼呈现出体色变黑、反应迟钝、身体失去平衡、呈螺旋状或旋转游动等典型的病毒性神经坏死症症状。在鱼体没有发现寄生虫或细菌感染，PCR检测发现病鱼感染了鱼类神经坏死病毒(NNV)。利用已经发表的NNV核酸序列设计引物，克隆该神经坏死病毒(PNNV)外壳蛋白基因并测序，通过同源性比较和系统进化分析发现该病毒与斜带石斑鱼神经坏死病毒(ECNNV)碱基相似率达99.2％，属于赤点石斑鱼神经坏死病毒基因型(RGNNV)。
　　 采用腹腔注射、肌肉注射、浸泡、投喂等4种方法进行人工感染试验。实验鱼感染PNNV4d后，陆续出现食欲下降、体色较深或发黑、游动无力、行为反应迟钝、身体失去平衡等病毒性神坏死症典型症状。死亡集中在攻毒后8～11d,攻毒后12d各感染组累计死亡率均达100％，而对照组无死亡。提取人工感染实验中具有典型症状鱼的脑组织总RNA，并进行RT-PCR检测，一扩阳性率达90％,PCR产物与PNNV的核酸序列完全相同。通过组织切片在光学显微镜下观察到病鱼的脑部组织存在明显空泡，视网膜也有明显空泡性坏死病变，而脊髓、鳃、心脏、肝脏、肾脏、脾和肌肉等器官没有发现明显的空泡。通过透射电镜可以在患病鱼脑和视网膜结缔组织的细胞质内可以观察到直径20-30nm的病毒粒子。病毒随机分布在细胞质中或者包在膜性结构内。偶尔可以观察到较大的致密体外膜已经破裂，病毒样粒子释放到细胞质中。以上实验结果表明NNV是湛江市卵形鲳鲹大规模死亡的致病原，也证明了卵形鲳鲹幼鱼是鱼类病毒性神经坏死症的易感种群，患病死亡率高，可达100％。
　　 本文根据RGNNV的RNA2的核苷酸序列，设计了一对特异性引物，采用荧光定量PCR(qPCR)研究NNV在卵形鲳鲹体内各组织中分布及增殖规律。在感染后4,8,12,24,36,48,72,96h以及发病死亡的鱼中各采集6尾用于qPCR检测。在感染后4h，除肝和肠以外其他各组织均含有较高的病毒量。尤其是脑组织，达到6.59±0.02log10copies/mg。各组织病毒增殖趋势均呈U字形（除肝和肠），并且病毒量分别在脑(12hp.i.)、心(12hp.i.)、鳃(12hp.i.)、脾(12hp.i.)、肌肉(24hp.i.)和肾(36hp.i.)时达到最低点。脑组织在感染后36h，病毒含量达到平稳期，为109copys/mg，此浓度与发病濒死或新鲜死亡个体组织中的浓度是一致的，其他组织都在感染后96h病毒含量达到最高浓度。证明此时，RGNNV已经扩散至实验鱼体内各个组织。
　　 本文还建立了一种以环介导等温扩增技术(LAMP)为基础的便捷、灵敏度高、特异性好赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)快速检测方法。该方法以RGNNV型基因组RNA序列为基础设计的4条特异性引物（2条外引物和2条内引物）只能扩增该病毒的核酸序列，而不能扩增对虾白斑综合症病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、锯缘青蟹呼肠孤病毒、草鱼出血病病毒，说明该方法具有很高的特异性；本文还优化了该方法的反应条件，建立了最佳反应体系；以10倍系列稀释的RGNNV cDNA为模板对LAMP和nested-PCR进行灵敏度检测发现LAMP法的灵敏度比nested-PCR法高100倍。

目录

文摘

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第一章 引言

1 神经坏死病毒的研究概述

1.1 神经坏死病毒的分类

1.2 神经坏死病毒的危害

1.3 神经坏死病毒的传播途径

1.4 病毒性神经坏死病的症状

1.5 病毒性神经坏死病组织病理学

1.6 神经坏死病毒的检测方法

2 LAMP法的研究进展

2.1 反应原理

2.2 引物设计

2.3 反应体系

2.4 产物检测

2.5 在病毒检测中的应用

3 研究目的和意义

第二章 湛江地区网箱养殖卵形鲳鲹大规模死亡原因初步调查

1 材料

1.1 采样地点

1.2 菌种与质粒

1.3 主要仪器设备

1.4 主要试剂

1.5 主要试剂配置方法

2 方法

2.1 样品

2.2 寄生虫检查

2.3 细菌检查

2.4 病毒检查

3 结果

3.1 病鱼临床症状

3.2 寄生虫检查

3.3 细菌检查

3.4 NNV检测及序列分析

4 讨论

第三章 神经坏死病毒对卵形鲳鲹幼鱼的致病性研究

1 材料

1.1 病毒来源

1.2 实验用鱼及饲养条件

1.3 主要仪器和设备

1.4 主要试剂

1.5 主要试剂配制方法

2 方法

2.1 病毒液制备

2.2 病毒感染及采样

2.3 病毒确认

2.4 H.E染色

2.5 透射电镜观察

3 结果

3.1 人工感染试验

3.2 病毒确认

3.3 H.E染色

3.4 电镜观察结果

4 讨论

第四章 神经坏死病毒在卵形鲳鲹体内的增殖规律研究

1 材料

1.1 病毒来源

1.2 实验用鱼及饲养条件

2 方法

2.1 病毒液提取

2.2 人工感染实验

2.3 采样

2.4 样品RNA抽提

2.5 cDNA合成

2.6 qPCR引物设计

2.7 普通PCR检测

2.8 qPCR

3 结果

3.1 人工感染实验

3.2 qPCR检测NNV

4 讨论

第五章 鱼类神经坏死病毒LAMP检测方法的建立

1 材料

1.1 样品

1.2 试剂

1.3 设备

2 方法

2.1 RNA抽提

2.2 cDNA合成

2.3 引物设计

2.4 LAMP反应条件的优化

2.5 产物检测

2.6 特异性检验

2.7 灵敏度试验

3 结果

3.1 LAMP法检测RGNNV反应条件的优化

3.2 产物检测

3.3 LAMP特异性试验

3.4 LAMP灵敏性试验

3.5 LAMP法的应用

4 讨论

小结

参考文献

缩略词

论文发表情况

发明专利

致谢