利用抗性筛选和基因组重排技术选育刺糖多孢菌提高多杀菌素产量

摘要

多杀菌素又称为多杀霉素是从刺糖多孢菌的发酵液中提取出来的一种具有高效杀虫活性的抗生素。此种抗生素具有生物农药的诸多优点：对害虫起效快、光照分解快、对非靶标动物安全，因此其市场前景非常广阔。目前，我国的多杀菌素主要依赖从欧美等国家进口。所以，产多杀菌素的菌种改良，提高其产量显得十分有意义。本实验中，结合了抗性筛选技术与基因组重排技术，以刺糖多孢菌ATCC49460为出发菌株，进行了高产菌株的筛选研究。
　　首先，本文优化了原生质体制备、原生质体再生和原生质体融合的各种条件。结果显示，原生质体制备的最佳条件为，250ml三角瓶装50ml的CSM培养基，并加入9颗灭过菌的玻璃株提供适当的机械剪切力，孢子悬液接种，30℃，200r/min，培养72小时；以10000r/min的离心力收集菌体，然后立刻用PB溶液洗涤两次；用含有0.2％溶菌酶的PB溶液在34℃水浴中酶解60min，400目纱布过滤，得到所需要的原生质体，-70℃下保存。最佳的再生条件为：在30℃的培养温度下，吸取0.2ml的原生质体均匀涂布在3号再生培养基上。最佳的融合条件为：将制备好的原生质体的1：1混合后，用40%的PEG4000处理5分钟。
　　其次，探索了刺糖多孢菌ATCC49460对红霉素和新霉素的最小抑制浓度，并利用抗生素抗性筛选技术构建了突变体库。刺糖多孢菌对红霉素和新霉素的最小抑制浓度为分别为40μg/ml和30μg/ml。将经紫外线诱变70s后的原生质体，分别涂布在含有40μg/ml红霉素和30μg/ml新霉素的再生培养基上，新生菌落既是突变体库。结合HPLC对产量的测定，最终筛选得到了具有红霉素抗性的高产菌株 Ery-13，其产量为180μg/mL；具有新霉素抗性的高产菌株 Neo-127，其产量为158μg/mL。经过对这两菌株的交叉抗性检测，Ery-13对新霉素抗性敏感，Neo-127对红霉素抗性敏感，所以这两菌株被用于基因组重排的出发菌株。
　　最后，对以上筛选得到的两菌株进行连续的4轮基因组重排。随着重排的深入，多杀菌素的产量也随之提高，最后筛选得到了一株同时具有红霉素和新霉素抗性（160μg/mL+140μg/mL）的高产菌株EN4-33，其产量达到了331μg/mL,是原始菌株的6.6倍。并对其发酵特性做了测定，发现与原始菌株49460相比，其菌体生长速度快，对培养基中的葡萄糖和可溶性氨基氮的消耗量也要大。
　　由此可见，将抗生素抗性筛选技术与基因组重排技术相结合应用在刺糖多孢菌的菌株改良上是可行的，为其他菌种的改良提供了思路。

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第一章文献综述

引言

1.1多杀菌素的简介

1.2育种的方法简介

1.3基因组重排育种

第二章原生质体制备和再生条件研究

2.1引 言

2.2实验材料、试剂与仪器

2.3实验方法

2.4结果与分析

2.5讨论

第三章 原生质体诱变及抗性突变体库构建

3.1引言

3.2实验材料，试剂与仪器

3.3实验方法

3.4结果分析

3.5讨论

第四章基因组重排

4.1引言

4.2实验材料，试剂与仪器

4.3实验方法

4.4结果分析

4.5讨论

全文总结

参考文献

致谢