草菇碳水化合物活性酶编码基因在不同基质降解中的表达水平及新型糖苷水解酶GH61家族基因的分子生物学特性研究

摘要

草菇（Volv ariella v olv acea）是一种可以利用稻草、废棉等农业剩余资源进行人工栽培的大型真菌，其营养价值高味道鲜美深受广大消费者的喜爱。早期以稻草秸秆为主要原料栽培草菇，其生物学效率低仅为10％～20%，后期改进栽培原料及方式以废棉进行栽培，其生物学效率提高到25%～40%。草菇生物学效率与其降解栽培基质中木质纤维素类物质密切相关，对草菇中基质降解相关基因进行研究可以为了解栽培基质的组成与基质降解相关基因的表达水平之间的关系提供依据，为进一步定位基质降解的关键基因提供工作基础。
　　本研究选取草菇菌丝阶段，通过基因芯片技术，对生长在稻草秸秆基质和棉纤维基质上草菇菌丝基因表达情况进行分析，重点比较了碳水化合物活性酶（CAZyase）编码基因的表达水平，发现GH61家族基因表达活跃，并进一步对其进行生物学特性研究。具体实验结果如下：
　　1.对稻草和棉花培养基上草菇菌丝的基因表达情况进行分析，在筛选出差异基因后，分别对其进行基因功能和代谢通路分析发现：（1）基因功能分析方面，稻草基质上高表达基因主要集中在与木质纤维素降解相关基因功能、阳离子结合以及钙、锰等多种离子的转运过程；代谢通路方面，基因主要集中在酚类、烯烃类、芳烃化合物等多条异源物质代谢途径。（2）棉纤维基质上高表达基因主要集中在氧化还原活性上，以及细胞分裂、DN A复制等与生长增殖相关的过程。稻草秸秆成分复杂，草菇表达大量异源物质降解相关基因，可能消耗较多能量，而棉纤维基质上高表达的基因主要与生长等生物过程相关，草菇在棉纤维基质上表达少量的基质降解基因便可以满足棉花基质上更快生长速度的能量需求。
　　2.对碳水化合物活性酶编码基因的表达情况进行分析，发现基因表达情况总体呈现易被利用成分（淀粉等）的相关基因表达活跃，难分解成分（木质纤维素）对应的基因表达水平较低；稻草基质上高表达基因较多，棉纤维基质上高表达基因较少。其中GH61家族基因表达情况特殊，草菇基因组中共发现30个GH61家族同源基因，在稻草基质上高表达的57个CAZyase编码基因中GH61基因占11个，棉纤维基质上高表达的8个CAZyase编码基因中占4个，剩下的15个GH61基因总体上在两种培养基上都处于相对高表达的状态，GH61家族基因在基质利用的过程中可能发挥着重要的功能。
　　3.对草菇中注释到的30个GH61家族基因进行生物信息学分析，发现这些基因存在大量的串联重复现象，序列一致性分析发现30个基因之间的氨基酸序列一致性低，但串联基因之间序列一致性高。系统发育树和内含子外显子结构显示串联重复基因聚在系统发育树的同一进化枝上，并具有相似的基因结构。基本性质预测方面，30个GH61基因间差异较大，分子量、等电点差别明显，除含有Glyco_hydro_61功能域外还存在多种功能域。
　　4.对14个真菌物种共174个GH61家族基因分析发现，不同物种之间GH61基因数目差异很大，基因串联成簇现象在其他物种中也普遍存在，成簇基因具有相近的进化位置。GH61基因在草菇和双胞蘑菇基因组中有相近的进化关系，两个物种的GH61基因在进化枝上彼此邻近。金属离子对其表达水平的影响分析，发现有27个GH61基因检测到转录活性。总体上，锰离子对其有不同程度的诱导作用，而铜离子的诱导作用不明显。

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第一章 引 言

1 草菇的概述

1.1 分类地位

1.2 形态特征

1.3 草菇栽培发展

2 真菌木质纤维素降解相关酶研究进展

2.1纤维素酶研究进展

2.2半纤维素酶研究进展

2.3木质素降解酶研究进展

2.4 GH61家族研究进展

2.5 CAZy编码基因

3木质纤维素降解酶的组学研究

3.1真菌木质纤维素降解酶的组学研究

3.2草菇中木质纤维素降解酶的组学研究进展

4. 研究的目的及意义

第二章 草菇不同基质上差异表达基因的研究

1 实验材料

1.1 供试菌株

1.2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2.1 培养基的配置

2.2 菌丝的处理及收集

2.3 总RNA的提取

2.4 草菇表达谱文库构建

2.5 数据分析

2.6 荧光定量PCR 验证表达谱数据

3 结果与分析

3.1 草菇菌丝的生长情况

3.2 RNA 的提取及质检

3.3 数据预处理

3.4不同基质间草菇差异表达基因的分析

3.5不同生长时期草菇差异表达基因的分析

3.6 草菇CAZyase编码基因表达情况分析

3.7 荧光定量PCR验证芯片结果

4 小结与讨论

4.1草菇在不同基质上的基因表达情况

4.2草菇不同生长时期基因的表达情况

4.3 GH61家族在基质降解过程中可能发挥重要作用

第三章 草菇GH61家族基因的生物信息学分析及金属离子对其表达水平的影响

1 实验材料

1.1 供试菌株及基因信息来源

1.2 实验试剂及仪器

2实验方法

2.1 GH61家族基因信息获得及位置分析

2.2 基本生物信息学分析

2.3 构建系统发育树及内含子外显子结构图

2.4 供试菌株及培养

2.5 RNA提取、cDNA的合成和荧光定量PCR

3结果与分析

3.1草菇GH61家族基因串联重复现象

3.2草菇GH61家族蛋白的性质

3.3草菇GH61家族基因系统发育树及基因结构分析

3.4 GH61家族基因在真菌中的串联现象及系统发育树

3.5铜、锰离子对草菇GH61家族基因表达的影响

4小结与讨论

4.1草菇GH61家族基因的串联重复现象

4.2 GH61家族基因之间基本性质差异显著

4.3金属离子对GH61家族基因的影响

附录

参考文献

致谢

论文发表及参加会议

发表论文

参加会议