不同脂肪酸对中华绒螯蟹脂肪酸结合蛋白FABP3,FABP9,FABP10的表达调控

摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹，属甲壳纲，十足目，方蟹科，绒螯蟹属，目前已经成为我国重要养殖的经济蟹类。脂类在鱼类、虾蟹类等水产动物的生长、生理活动中发挥十分重要的作用，而肝胰腺是中华绒螯蟹脂类代谢中心，脂类含量对其结构、功能和生化组成具有重要影响。脂肪酸结合蛋白FABP的种类和分布与其结合的脂肪酸、组织的脂肪酸需求及其参与的功能有着密切关系。研究表明甲壳动物FABP的种类分化较少但参与多种生理过程，而目前对其配基及亲和力及功能的研究甚少。本研究在已有的研究结果基础上，采用RT-PCR技术从中华绒螯蟹肝胰腺组织中克隆了FABP3、FABP9和FABP10基因，通过分子生物学手段构建原核表达载体，经过表达和纯化获得Es-FABP3、9和10三种可溶性目的蛋白并以此蛋白作为材料，利用稳态荧光光谱对中华绒螯蟹FABP与脂肪酸等疏水配基的亲和力进行分析，并在离体条件下通过荧光定量PCR研究单一脂肪酸对Es-FABP3、9和10的调控作用。通过以上研究阐明中华绒螯蟹FABP与脂肪酸的亲和力，脂肪酸代谢相关基因FABP3、FABP9和FABP10在不同脂肪酸调控下的相互作用关系，同时为甲壳动物FABP分化与功能研究的深入提供基础资料。主要研究结果和结论具体如下：
　　1、FABP3、FABP9、FABP10原核表达及蛋白纯化
　　通过NCBI GenBank数据库查询3中脂肪酸结合蛋白核苷酸序列，根据FABP3、FABP9和FABP10的核苷酸序列设计扩增引物，在上下游分别插入酶切位点Bam HI和Nde I。从中华绒螯蟹肝胰腺组织中提取总RNA，通过RT-PCR技术得到cDNA，以此为模板进行TA克隆得到带有酶切位点的FABP3、FABP9和FABP10基因，将扩增产物回收并纯化，电泳分析其条带约为400bp，与预期结果相符。将获得的目的基因与pMD-19T载体连接，PCR鉴定并测序，将测序正确的质粒酶切后回收目的片段。将目的基因正向插入pET-15b中，构建原核表达载体pET-15b-FABP3、pET-15b-FABP9和pET-15b-FABP10，将这三种质粒转化入宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导成功表达了目的蛋白，经过SDS-PAGE电泳显示，蛋白质分子质量均在15KD左右，与预期结果相符。利用融合蛋白中带有的His标签，经过镍离子柱亲和层析纯化表达的FABP3、FABP9和FABP10，以此为材料进行后续实验。
　　2、FABP3、FABP9、FABP10与不同脂肪酸亲和力分析
　　获得中华绒螯蟹脂肪酸结合蛋白FABP3、FABP9和FABP10重组可溶性蛋白后，采用稳态荧光技术研究不同脂肪酸与中华绒螯蟹FABP3、FABP9和FABP10的结合特性。利用ANS作为荧光标记，通过稳态荧光发射光谱研究脂肪酸与三种FABP的结合，通过解离常数的计算最终计算得到FABP3、FABP9和FABP10与不同脂肪酸亲和力大小。结果显示FABP3与长链脂肪酸有较高亲和力，FABP9与不同脂肪酸的亲和力大小随着碳链的延长，亲和力逐渐变小，FABP10则与短链脂肪酸有较高的亲和力。因此我们推测FABP3、FABP9和FABP10与不同脂肪酸亲和力不同与FABP的功能以及内腔结构的不同相关。
　　3、不同脂肪酸作用肝胰腺其FABP3、FABP9和FABP10表达变化
　　本论文采用离体培养技术，旨在研究不同脂肪酸水平对中华绒螯蟹肝胰腺中脂肪酸结合蛋白FABP3，FABP9和FABP10表达量的影响。取中华绒螯蟹肝胰腺组织进行体外培养，在液体培养基中分别加入50μm/L，100μm/L和250μm/L三种浓度的棕榈酸(PA)，油酸(OA)，亚油酸(LA)，花生四烯酸(ARA)，DHA和EPA六种脂肪酸。分别在离体培养24小时后，运用 Real-Time PCR技术，研究组织内FABP3、FABP9和 FABP10在不同种脂肪酸作用下的表达变化。结果表明，在培养基中加入50μm/L，100μm/L，250μm/L DHA、EPA和亚油酸，体外培养24h后，都促进了FABP9基因的表达。其中DHA组在100μm/L时FABP9基因的表达量最高；而FABP3和FABP10的表达量在加入三种浓度DHA条件并未受到显著影响。亚油酸组则在250μm/L时FABP9的表达量最高；而FABP3和FABP10基因表达量在加入三种浓度DHA条件并未受到显著影响。在培养基中添加三种浓度的花生四烯酸，油酸和棕榈酸体外培养24 h后，FABP3、FABP9和FABP10的表达量都没有显著性差异。FABP3、FABP9和 FABP10的表达水平对脂肪酸的种类和浓度反应不同，可能与实验动物所处的生理时期及对脂肪酸的需求有关。

目录

声明

第一章 引言(综述)

前言

1.1 研究现状

1.2脂肪酸结合蛋白的功能

1.3 结语

第二章 FABP3、FABP9和FABP10原核表达及蛋白纯化

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 不同脂肪酸作用肝胰腺其FABP3、FABP9、FABP10表达变化

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 FABP3、FABP9、FABP10与不同脂肪酸亲和力分析

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

小结

参考文献

攻读硕士期间参与的科研项目及发表的相关论文

致谢