青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗线粒体基因组序列测定及分析

摘要

线粒体基因组作为研究基因组结构、功能和进化的最佳模型，相关研究已经取得较为丰硕的成果。目前GenBank收录的节肢动物线粒体基因组数据已经多达126种，但仅有非洲飞蝗(Locusta migratoria migratoioides)和东方蝼蛄(Grvllotalpa orientalis)两种直翅目昆虫线粒体基因组被完全测出。为了丰富直翅目昆虫线粒体基因组数据，进一步深入开展直翅目昆虫线粒体基因组的结构与进化特征的研究，本课题选取直翅目蝗总科网翅蝗科的青脊竹蝗(Ceracris nigricornisnigricornis)、瘤锥蝗科的云南蝗(Yunnanites coriacea)、斑翅蝗科的亚洲飞蝗(Locusta migratoria migratoria)，利用长PCR与二次PCR策略进行线粒体基因组测序。完成三个物种线粒体基因组序列的拼接及注释工作之后，结合非洲飞蝗与东方蝼蛄的线粒体基因组数据，主要从线粒体蛋白质基因、tRNA基因、rRNA基因以及控制区四个方面对直翅目五个种的线粒体基因组进行了详细地比较及分析。对线粒体蛋白质基因的碱基组成、密码子和氨基酸使用、tRNA和rRNA的二级结构以及控制区的保守序列和茎环结构等方面进行了系统的比较与归纳，获得以下结论： 1．青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗的全线粒体基因组长度分别为15598bp、15566bp和16053bp，A+T含量分别为75.23％、74.60％和75.53％，均包含了37个基因和一段富含AT的非编码控制区序列，基因排列顺序与已经报道的非洲飞蝗的基因顺序和转录方向完全一致，由典型的节肢动物线粒体tRNA的KD排列转变为DK排列。与非洲飞蝗和东方蝼蛄比较发现，基因间隔区和基因重叠区的数目、长度在五个直翅目物种中均较为相似，间隔序列最长之处皆位于tRNA<'Ser(S-UCN)>与ND1基因之间。 2．青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗的线粒体全部蛋白质编码基因的碱基组成具有显著的偏向性。比较五种直翅目昆虫的蛋白质密码子第1、2、3位点的碱基组成，发现一个共同的规律：密码子第2位点的T含量显著高出A含量的一倍多；密码子第3位点的A、T含量最高，接近90％，且A和T的含量相当。J链编码的蛋白质基因和N链编码的蛋白质基因的密码子第3位点碱基组成偏斜率存在较大差异，J链富含AC，N链富含TG。分析结果表明线粒体基因组存在很强的GC→AT的进化选择压力，且J链和N链所承受的进化选择压力有所不同。 3．比较五种直翅目昆虫蛋白质基因起始与终止密码子，其中，青脊竹蝗、云南蝗、亚洲飞蝗与非洲飞蝗的线粒体蛋白质基因的起始密码子使用比较类似，有10个基因均以相同的ATN作为起始密码子，仅在COⅠ、COⅡ和ND2基因中有所区别，而云南蝗、亚洲飞蝗和非洲飞蝗的COⅠ起始密码子比较特殊，分别为CTG、ATTA和ATAA。这四个物种在终止密码子使用方面，13个蛋白质基因多数使用完整的终止密码子TAA或TAG，少数使用不完整的终止密码子TA或T。然而东方蝼蛄的ND2起始密码子为GTG，且仅有3个基因有完整的终止密码子。 4．青脊竹蝗、云南蝗、亚洲飞蝗、非洲飞蝗和东方蝼蛄蛋白质基因的密码子使用和氨基酸使用均具有极强的偏向性，同义密码子NNU和NNA的使用频率相当高。氨基酸组成中Leu、Ile、Ser和Phe的含量最高，这四种氨基酸百分比之和依次为43.8％，43.91％，43.07％，43.00％，42.69％。 5．青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗线粒体基因组22个tRNA基因的顺序均与非洲飞蝗相同，长度在63～72bp之间，tRNA二级结构在三个物种中也比较类似，共同特征为tRNA<'Ser>(S-AGN)>二级结构缺少了DHU臂，剩余21个基因都能够形成完整的三叶草结构，碱基错配以G-U为主。 6．比较青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗线粒体基因组两个rRNA基因的部分二级结构，发现rRNA二级结构差异较大的部位主要存在于环区，而茎区相对保守。 7．发现了青脊竹蝗、云南蝗、亚洲飞蝗和非洲飞蝗线粒体控制区保守区域BlockA、Block B、Block E1、Block E2及Block F(云南蝗缺少Block F)，且保守区域Block E1和Block E2与其间序列共同形成一个典型的茎环二级结构，5’端以...TTATAT 开始，3’端则以G(A)n(t)为主要特征。推测此茎环结构可能在线粒体基因复制起始中起调控作用。 8．亚洲飞蝗线粒体控制区(1189bp)存在四段嵌套高度保守的串联重复序列，其中前两段重复子单元紧密相连，后两段重复单元也紧密相连，各自形成两段较长的重复序列，repeat region1 和repeat_region 2，两段长的重复序列之间间隔31bp。亚洲飞蝗控制区repeat region1延伸到12S rRNA的下游，这一现象与非洲飞蝗完全一致。 9．通过将3种新测出的线粒体基因组与非洲飞蝗和东方蝼蛄线粒体基因组序列进行比较分析，从结构、比较与进化基因组学的角度总结了直翅目线粒体基因组的结构组成以及序列进化等方面的一般特征。 本研究首次对直翅目蝗总科的青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗线粒体基因组进行了序列测定、拼接及线粒体基因组注释和分析，丰富了直翅目昆虫的线粒体基因组数据，为进一步开展昆虫线粒体谱系基因组学的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分前言

1基因组学研究概述

1.1基因组及基因组学简介

1.2基因组学研究现状

1.3基因组学研究的发展及应用

2基因组研究技术和方法

2.1基因组测序策略

2.2基因组序列数据的拼接及注释

3线粒体基因组的研究概况

3.1线粒体及线粒体基因组

3.2动物线粒体基因组的主要特征

3.3动物线粒体基因组各组分的特征

3.4动物线粒体基因组测序进展及应用价值

4直翅目昆虫线粒体基因组研究现状

4.1直翅目昆虫简介

4.2直翅目昆虫全线粒体基因组研究现状

4.3青脊竹蝗、云南蝗与亚洲飞蝗介绍

5研究目的及意义

第二部分实验材料与方法

1实验材料

1.1标本的采集、保存、选择与鉴定

1.2实验仪器和试剂

2实验方法

2.1总DNA提取

2.2长PCR及二次PCR引物的设计

2.3长PCR扩增及产物的纯化

2.4二次PCR扩增及产物的纯化

2.5序列测定

3序列数据的初步分析

3.1测序结果的检查与校对

3.2测序片段的拼接和组装

3.3线粒体基因组的注释

第三部分实验结果

1总DNA提取

2长PCR

3二次PCR

4序列测定

5序列组装

第四部分青脊竹蝗线粒体基因组

1青脊竹蝗线粒体基因组的结构组成及基本特征

1.1基因组结构与基因顺序

1.2基因重叠区和基因间隔序列

1.3核苷酸组成特征

2蛋白质基因

2.1蛋白质基因碱基组成偏向性

2.2蛋白质基因密码子的使用

2.3蛋白质基因氨基酸组成

3 tRNA基因

4 rRNA基因

5控制区

第五部分云南蝗线粒体基因组

1云南蝗线粒体基因组的结构组成及基本特征

1.1基因组结构与基因顺序

1.2基因重叠区和基因间隔序列

1.3核苷酸组成特征

2蛋白质基因

2.1蛋白质基因碱基组成偏向性

2.2蛋白质基因密码子的使用

2.3蛋白质基因氨基酸组成

3 tRNA基因

4 rRNA基因

5控制区

第六部分亚洲飞蝗线粒体基因组

1亚洲飞蝗线粒体基因组的结构组成及基本特征

1.1基因组结构与基因顺序

1.2基因重叠区和基因间隔序列

1.3核苷酸组成特征

2蛋白质基因

2.1蛋白质基因碱基组成偏向性

2.2蛋白质基因密码子的使用

2.3蛋白质基因氨基酸组成

3 tRNA基因

4 rRNA基因

5控制区

第七部分直翅目昆虫线粒体基因组比较分析及讨论

1线粒体基因组的整体比较

1.1线粒体基因组的结构组成和基因顺序比较

1.2线粒体基因组的基因间隔区和基因重叠区比较

1.3线粒体基因组的碱基组成比较

2蛋白质编码基因的比较和分析

2.1蛋白质编码基因的碱基组成

2.2蛋白质基因密码子的使用

2.3蛋白质基因氨基酸组成比较

2.4蛋白质基因的亲水性结构分析

3 tRNA基因二级结构的比较与分析

4 rRNA基因的比较分析

5控制区序列的比较分析

第八部分结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间的研究成果